·                Οι γυναίκες ηλικίας από 21 ετών έως και 29 ετών, να ελέγχονται ανά 3ετία, με κυτταρολογία.

·                Οι γυναίκες ηλικίας από 30 έως και 65 ετών, να ελέγχονται ανά 3ετία, με συνδυασμό κυτταρολογίας και μοριακού ελέγχου HR-HPV (Co-testing).

·                Να μην υπάρχει διαφοροποίηση ανάμεσα στις γυναίκες οι οποίες είναι εμβολιασμένες από εκείνες που δεν είναι εμβολιασμένες.

·                Ο κυτταρολογικός έλεγχος να γίνεται κατά προτίμηση με τη μέθοδο της υγρής φάσης (co-testing).
Η μέθοδος της συμβατικής κυτταρολογίας είναι εξίσου αποδεκτή (σταδιακή καθιέρωση).

·                Αναφορικά με τις διενεργούμενες μοριακές HR-HPV εξετάσεις προτείνονται όσες είναι FDA - approved ή CE - IVD.

·                Όλα τα Εργαστήρια που θα παρέχουν τις υπηρεσίες τους στο Πρόγραμμα Προσυμπτωματικού Ελέγχου (Screening) του Καρκίνου του τραχήλου της μήτρας θα πρέπει να είναι σύμφωνα με τις επικυρωμένες προδιαγραφές.
Ο εκσυγχρονισμός των Εργαστηρίων σύμφωνα με το πρότυπο ISO 15189 εκφράζεται ως ευχή ότι θα συμβάλλει σταδιακά στην ποιοτική βελτίωση των παρεχόμενων διαγνωστικών υπηρεσιών.

^{Αρ. Πρωτ Α1β/Γ.Π.οικ.: 26081/04-04-2017 ΑΔΑ:72ΠΑ465ΦΥΟ-3ΕΤ ΑΠΟΦΑΣΗ ΥΠ. ΥΓΕΙΑΣ ΓΙΑ ΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ Ο.Ε.
Αρ. Πρωτ Α1β/Γ.Π.οικ.: 72976/16-10-2017 ΑΔΑ:72Ψ9465ΦΥΟ-ΗΣ4 ΑΠΟΦΑΣΗ ΥΠ. ΥΓΕΙΑΣ ΓΙΑ ΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ Ο.Ε.}

Μαρία Νασιουτζίκη - Γενική Γραμματέας Ελληνικής Εταιρείας Κλινικής Κυτταρολογίας

Γεώργιος Μαρκάκης - Αντιπρόεδρος Ελληνικής Εταιρείας Κλινική

Η διεύρυνση των διαγνωστικών εφαρμογών της Κυτταρολογίας και οι αυξανόμενες ανάγκες διερεύνησης των μοριακών/γενετικών αλλαγών των όγκων στην κλινική πράξη, κυρίως στα πλαίσια της ιατρικής ακριβείας, επιβάλλουν τη χρήση των κυτταρολογικών υλικών για τις αντίστοιχες μοριακές δοκιμασίες. Διεθνώς, οι οδηγίες για τις εφαρμογές μοριακών διαγνωστικών τεστ διαμορφώνονται από επιστημονικές εταιρείες παθολόγων – ογκολόγων (ASCO, ESMO), παθολογοανατόμων (CAP, ESP), καθώς και από διεπιστημονικές εταιρείες όπως η IASLC, ώστε να γίνουν αποδεκτές από τα εθνικά συμβούλια ογκολογίας με όποιον τρόπο αυτά είναι διαμορφωμένα στις διάφορες χώρες και να τεθούν σε εφαρμογή. Στο πλαίσιο της ιατρικής ακριβείας, οι δείκτες πρόβλεψης απάντησης σε στοχευτικά φάρμακα ελέγχονται σε υλικό από τον όγκο για την επιλογή του κατάλληλου φαρμακευτικού μέσου για τον/την ασθενή, περιλαμβάνουν δε πρωτεΐνες, οι οποίες ελέγχονται με ανοσοκυτταροχημεία, και γενωμικές αλλαγές, οι οποίες ελέγχονται σε υπόστρωμα DNA ή RNA με μεθόδους που βασίζονται στην PCR ή, πιο περιορισμένα, με in situ υβριδισμό.

Για τους περισσότερους τύπους όγκων οι ισχύουσες διεθνείς οδηγίες έχουν διαμορφωθεί για την εφαρμογή μοριακών δοκιμασιών και την αξιολόγηση μοριακών δεικτών σε ιστολογικές τομές, τόσο από την πλευρά της κλινικής απαίτησης όσο και από την πλευρά της τεχνικής στο εργαστήριο. Βεβαίως, τα κυτταρολογικά υλικά μπορούν, και είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν για τον μοριακό χαρακτηρισμό των όγκων όταν δεν υπάρχει δυνατότητα λήψης ιστικής βιοψίας . Επί του παρόντος ωστόσο, εκτός από τον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα , για τους υπόλοιπους τύπους καρκίνου δεν υπάρχουν διεθνείς οδηγίες για τη διαγνωστική χρήση μοριακών δεικτών για την επιλογή στοχευτικών φαρμάκων σε κυτταρολογικά υλικά από την πλευρά της κλινικής, ενώ λείπει εμπεριστατωμένη προσαρμογή του αλγορίθμου αξιολόγησης των αποτελεσμάτων της μεθόδου από την εργαστηριακή πλευρά, ακόμη και για ευρέως χρησιμοποιούμενους δείκτες.

Σε κάθε περίπτωση, για τη διαγνωστική διερεύνηση προβλεπτικών μοριακών δεικτών στα κυτταρολογικά υλικά ισχύει:

• Η εντολή για τη διερεύνηση του προβλεπτικού δείκτη υποβάλλεται από τον κλινικό γιατρό και καθορίζεται από τις διεθνείς οδηγίες κλινικής πρακτικής.

• Η μορφολογική εκτίμηση του κυτταρολογικού υλικού στο οπτικό μικροσκόπιο είναι απαραίτητη και προηγείται της επεξεργασίας για μοριακό έλεγχο.

• Το ποσοστό και ο συνολικός αριθμός των καρκινικών κυττάρων (tumor cellularity, TC) καθορίζουν την καταλληλότητα του κυτταρολογικού δείγματος για μοριακή διερεύνηση.

• Ο προσδιορισμός της TC για αρκετά είδη όγκων αποτελεί εγγενές πρόβλημα στα κυτταρολογικά υλικά.

• Η προοπτική vs. αναδρομική διερεύνηση μοριακών δεικτών σε κυτταρολογικό υλικό χαρακτηρίζονται από διαφορετικά προ-αναλυτικά χαρακτηριστικά που επηρεάζουν την ποιότητα του μοριακού υποστρώματος και, επομένως, το τελικό αποτέλεσμα (Εικόνα 1).

• Σε οργανωμένο κέντρο με συνεργασία κλινικών – ακτινολόγων - κυτταρολόγων, η προοπτική επεξεργασία και χρήση του κυτταρολογικού υλικού με επαρκές ποσοστό και αριθμό καρκινικών κυττάρων για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων μοριακών δεικτών είναι εξαιρετικά αξιόπιστη για θεραπευτική καθοδήγηση.

• Για μοριακούς δείκτες οι οποίοι μπορεί να συνυπάρχουν σε μη-κακοήθη κύτταρα που είναι δύσκολο να διαχωρισθούν σε υλικό αναρρόφησης, π.χ., έκφραση ER/PgR ή υπερέκφραση/ενίσχυση HER2 στον καρκίνο του μαστού, οι οδηγίες για την αξιολόγηση των αντίστοιχων αποτελεσμάτων είναι απαραίτητο να διαφοροποιηθούν ως προς τις ισχύουσες για ιστολογικά παρασκευάσματα.

• Το είδος του κυτταρολογικού δείγματος, η προοπτική ή αναδρομική επεξεργασία, η TC, τα αναλυτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου και τα κριτήρια αξιολόγησης του τελικού αποτελέσματος θα πρέπει να περιλαμβάνονται στην έκθεση της μοριακής διερεύνησης.

Εικόνα 1: Προοπτική και αναδρομική επεξεργασία κυτταρολογικών υλικών για τον προσδιορισμό μοριακών δεικτών για θεραπευτική καθοδήγηση. Προτεινόμενη διαδικασία προοπτικής διαχείρισης υλικών και δυνατότητα προσδιορισμού μοριακών δεικτών.

Η αξιοπιστία της μοριακής διερεύνησης σε κυτταρολογικά υλικά εξαρτάται από τις δυνατότητες που προσφέρει το υλικό για τον προσδιορισμό του συγκεκριμένου δείκτη με τη συγκεκριμένη μέθοδο. Παρακάτω παρουσιάζονται τα χαρακτηριστικά των τριών αυτών ενοτήτων σε συνάρτηση μεταξύ τους και δίνονται κατευθύνσεις για τον διαγνωστικό προσδιορισμό σε κυτταρολογικά υλικά μοριακών δεικτών που αποτελούν φαρμακευτικούς στόχους σε συμπαγείς όγκους.

Α. Κυτταρολογικά υλικά

Η γνώση των εγγενών χαρακτηριστικών και ο χειρισμός του βιολογικού υλικού αποτελούν τη βάση για την επιτυχία του προσδιορισμού κάθε μοριακού δείκτη, των μοριακών δεικτών για θεραπευτική επιλογή συμπεριλαμβανομένων.

Περιεχόμενο σε κακοήθη κύτταρα (TC): ο ακριβής προσδιορισμός TC αποτελεί εγγενές πρόβλημα στα κυτταρολογικά υλικά.

• Επαρκής TC για τις περισσότερες PCR-based μεθόδους θεωρείται το 20% (δηλαδή, 20% κακοήθη κύτταρα στο σύνολο των κυττάρων του δείγματος), ωστόσο αυτή η ανάγκη μπορεί να μειωθεί υπό προϋποθέσεις (Εικόνα 1). Το ποσοστό αυξάνεται όσο χειρότερης, και μειώνεται όσο καλύτερης ποιότητας είναι το μοριακό υπόστρωμα που απομονώνουμε, όπως ισχύει και για τα ιστολογικά παρασκευάσματα .

• Για τις περισσότερες in situ μεθόδους (ανοσοκυτταροχημεία – FISH) απαιτείται συνολικός αριθμός τουλάχιστον 100 κακοήθων κυττάρων για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων.

• Δείγματα παρακέντησης με λεπτή βελόνα (FNA), ιδίως όταν η βιοψία είναι καθοδηγούμενη απεικονιστικά, συνήθως περιέχουν μεγαλύτερο αριθμό καρκινικών κυττάρων.

Ταυτοποίηση κακοήθων κυττάρων: απαιτείται ο αποκλεισμός μη-κακοήθων κυττάρων για την αξιολόγηση όλων των δεικτών (διαγνωστικό κυτταρολογικό πρόβλημα κατά περίπτωση). Κλασσικό παράδειγμα, η ανάγκη αποκλεισμού in situ ή ποικίλλων προκαρκινικών βλαβών σε FNA από καρκίνο μαστού. Σε αυτές τις περιπτώσεις μπορεί ο έλεγχος να συμπληρωθεί με ανοσοκυτταροχημεία για μυοεπιθηλιακούς δείκτες ώστε να αποκλεισθούν οι συγκεκριμένες αλλοιώσεις από την καταμέτρηση των καρκινικών κυττάρων.

Κυτταρολογικό αρχείο: Επίσης εγγενές πρόβλημα των κυτταρολογικών υλικών είναι η δυσκολία δημιουργίας αρχείου με διαγνωστικό υλικό αντίστοιχο με αυτό που χρησιμοποιήθηκε για την αρχική διάγνωση. Το κυτταρολογικό αρχείο περιλαμβάνει υποχρεωτικά τα βαμμένα διαγνωστικά πλακίδια.

Cell block

• Η παρασκευή cell block δίνει τη δυνατότητα της επ’ άπειρον αποθήκευσης του κυτταρολογικού υλικού (όπως και στους κύβους παραφίνης [FFPE] των ιστολογικών παρασκευασμάτων). Δεν πρόκειται για ιστολογικό παρασκεύασμα, αρχειοθετείται όμως με τον ίδιο τρόπο. Η παρασκευή του όμως προϋποθέτει την ύπαρξη επαρκούς ποσότητας υλικού.

• Οι μεταβολές που υφίστανται τα βιομόρια κατά την επεξεργασία και αποθήκευση σε cell block είναι παρόμοιες με αυτές των FFPE ιστών. Ωστόσο, καθώς ο χρόνος παραμονής στη φορμόλη είναι σχετικά μικρότερος από τα ιστολογικά, η διατήρηση των βιομορίων γενικά υπερέχει στο cell block.

• Δυνατότητα περισσότερο αξιόπιστου προσδιορισμού TC για το δείγμα σε σύγκριση με τα επιστρωμένα πλακίδια με οποιαδήποτε μέθοδο.

• Η αξιολόγηση της TC γίνεται σε τομές Η&Ε, προφανώς πριν και όχι μετά την επεξεργασία για μοριακή ανάλυση

  • Προσοχή: η TC στο cell block δεν αντιστοιχεί απαραίτητα στην TC του συνοδού δείγματος που επεξεργαζόμαστε σε υγρή φάση (LBC)

  • Τομές cell block: ιδανικές για την εφαρμογή in situ μεθόδων, ειδικά όταν υπάρχει επάρκεια TC.

• Τομές 4 – 10μm χρησιμοποιούνται για την απομόνωση DNA/RNA για PCR-based μεθόδους

• H μακροεκτομή ή μικροεκτομή με laser (η οποία δεν εφαρμόζεται ευρέως) γίνονται με βάση την αξιολόγηση της τομής Η&Ε από τις χοντρές άβαφες τομές για εμπλουτισμό του δείγματος σε DNA/RNA από κακοήθη κύτταρα.

• Cell blocks μπορούν να προέρχονται από δείγματα φρέσκα με ή χωρίς (σε ROSE - ταχεία αξιολόγηση κυτταρολογικού υλικού) φυσιολογικό ορό (υπό την προϋπόθεση άμεσης αποστολής στο Κυτταρολογικό Εργαστήριο) ή μονιμοποιημένα σε φορμόλη ή αιθανόλη ή αλκοολούχο μονιμοποιητικό διάλυμα υγρής φάσης ή αυτοματοποιημένη τεχνική (Cellient). Η τεχνική μονιμοποίησης σε φορμόλη (φυγοκέντρηση, απόρριψη του υπερκείμενου και εγκλεισμός του ιζήματος σε “collodion bag”) υπερτερεί σε σχέση με τις υπόλοιπες μεθόδους (υλικό σε φυσιολογικό ορό και πήξη με την τεχνική πλάσματος-θρομβίνης, υλικό σε φορμόλη και πήξη με την τεχνική histogel κ.λπ.). Μετά την επεξεργασία τους, όλα τα CBs θα πρέπει να τοποθετούνται σε φορμόλη.

«Υγρά» κυτταρολογικά υλικά

• Η κυτταρολογία υγρής φάσης (LBC) δίνει τη δυνατότητα πρόσκαιρης αποθήκευσης του κυτταρολογικού δείγματος. Ο χρόνος 6 μηνών (μέχρι και 12 μήνες) είναι γενικά αποδεκτός για τη χρήση του υλικού LBC για περαιτέρω έρευνα.

• Η αναδρομική χρήση επιστρωμένων βαμμένων πλακιδίων για μοριακή διερεύνηση εμπεριέχει πολλά προβλήματα που κάνουν τη διαδικασία αναξιόπιστη και συχνά μάταιη. Τα προ-αναλυτικά θέματα περιγράφονται αναλυτικά στην πρόσφατη βιβλιογραφία .

  • Τα πλακίδια μετά από LBC ενδεχομένως αποδίδουν καλύτερη ποιότητα DNA, ωστόσο είναι γενικά πτωχότερα σε περιεχόμενο κακοήθων κυττάρων σε σύγκριση με άμεσες επιστρώσεις ή cytospins.

• Προτείνεται η χρήση non-frosted αντικειμενοφόρων πλακιδίων συγκριτικά με frosted πλακίδια καθώς παρέχεται μεγαλύτερη ευκολία στην αποκόλληση των επιστρωμένων κυττάρων που θα επιλεγούν για απομάκρυνση (μακρο- ή μικροεκτομή) και απομόνωση DNA. (να σημειωθεί ότι για την ανοσοκυτταροχημεία και τον in situ υβριδισμό προτιμώνται τα frosted πλακίδια, γιατί σε αυτές τις περιπτώσεις δεν είναι επιθυμητή η αποκόλληση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας τους.)

• H προσθήκη μικρής ποσότητας διαλύματος κυτταρικής λύσης (lysis buffer) στην επιφάνεια του επιχρίσματος, διευκολύνει τη διαδικασία κυτταρικής απόξεσης για μοριακή ανάλυση.

Προοπτική διαχείριση κυτταρολογικού υλικού για εξασφάλιση δυνατότητας μοριακής διερεύνησης: Στην Εικόνα 1 προτείνεται η προοπτική δημιουργία αρχείου του κυτταρικού περιεχομένου του δείγματος σε pellet (μετά από κατάλληλη επεξεργασία και φυγοκέντρηση) που διατηρούνται σε σωληνάρια σε βαθιά κατάψυξη (-80^ο C).

• Τα δείγματα αυτά διατηρούνται σχεδόν επ’ άπειρο και μπορούν να χρησιμοποιηθούν μελλοντικά για την απομόνωση DNA/RNA και εφαρμογή PCR-based μεθόδων, σε σύγκριση με την κυτταρομορφολογία στα αρχειοθετημένα διαγνωστικά πλακίδια και σε συσχέτιση με την TC που έχει προσδιορισθεί στο διαγνωστικό δείγμα.

• Εύλογα, η ποιότητα του μοριακού υποστρώματος που προκύπτει από τα δείγματα αυτά είναι άριστη, η επεξεργασία τους τεχνικά είναι στάνταρντ σε κάθε μοριακό εργαστήριο, και το σημείο – κλειδί είναι η TC, που θα πρέπει να έχει προσδιορισθεί κατά τη λήψη του κυτταρολογικού υλικού.

• Η πρακτική αυτή θα συντελέσει στην αξιοποίηση του κυτταρολογικού υλικού για τη διερεύνηση μοριακών δεικτών εφόσον υπάρξει μελλοντική ανάγκη.

Απευθείας επιχρίσματα και γενικά αρχειοθετημένα πλακίδια, που έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση

• Αποτελούν μία εναλλακτική πηγή υλικού σε περιπτώσεις cell-block ανεπαρκούς κυτταροβρίθειας, μετά από μικροεκτομή (micro-dissection/LCM/cell transfer).

• Προτείνεται η χρήση non-frosted αντικειμενοφόρων πλακιδίων συγκριτικά με frosted πλακίδια καθώς παρέχεται μεγαλύτερη ποσότητα DNA.

• H προσθήκη μικρής ποσότητας διαλύματος κυτταρικής λύσης (lysis buffer) στην επιφάνεια του επιχρίσματος, διευκολύνει τη διαδικασία κυτταρικής απόξεσης για μοριακή ανάλυση.

• Επιχρίσματα μονιμοποιημένα με αιθανόλη ή ξεραμένα στον αέρα παρέχουν εξίσου υψηλής ποιότητας DNA ανεξαρτήτως τεχνικής χρώσεως (Diff-Quick, Παπανικολάου), αν και η χρώση Diff-Quick προτιμάται σε περιπτώσεις που έχει προηγηθεί μεγάλης διάρκειας αποθήκευση των επιχρισμάτων (γιατί???).

• Προφανώς, το αρχείο αυτό δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για εφαρμογή in situ μεθόδων (ICC, FISH). Επιχρίσματα ξεραμένα στον αέρα (μη μονιμοποιημένα) ΔΕΝ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για εφαρμογή in situ μεθόδων (ICC, FISH).

Ψηφιοποίηση κυτταρολογικού μορφολογικού αρχείου

• Για ιατρονομικούς λόγους, σε περίπτωση ύπαρξης επίσης μοναδικού επιχρίσματος που περιέχει την πλειονότητα των νεοπλασματικών κυττάρων κατάλληλων για μοριακή ανάλυση, κρίνεται επιβεβλημένη η ψηφιακή καταχώρηση των αποδεικτικών νεοπλασματικών ευρημάτων.

• Η δημιουργία ψηφιακού κυτταρολογικού αρχείου (digital cytology) θα μπορούσε να συμβάλει τα μάλα (εκτός από τα γενικά πλεονεκτήματα αυτής της πρακτικής για τη διάγνωση) και στην προοπτική αξιολόγηση της TC και στην αναδρομική αξιολόγηση του υλικού για μοριακή διερεύνηση, εφόσον παράλληλα λειτουργεί η προοπτική διαχείριση που προτείνεται στην Εικόνα 1.

Β. Διαγνωστικοί μοριακοί δείκτες για την πρόβλεψη απάντησης σε θεραπευτικά μέσα

Πρωτεϊνική έκφραση: Οι πρωτεΐνες που λειτουργούν παθολογικά στον όγκο αποτελούν τον κατ’ εξοχήν φαρμακευτικό στόχο. Η παθολογική λειτουργία μπορεί να έχει ως βάση γενωμικές αλλαγές (μεταλλάξεις, χρωμοσωμικές μεταθέσεις, γονιδιακή ενίσχυση) ή υπερέκφραση λόγω διαταραχής της ρύθμισης του ελέγχου της γονιδιακής λειτουργίας και της μεταφραστικής διαδικασίας.

Απαιτούμενο: επαρκής ταυτοποίηση των κακοήθων κυττάρων για αξιολόγηση και αποκλεισμός των μη-κακοήθων κυττάρων που πιθανόν εμφανίζουν θετικότητα για τον ίδιο πρωτεϊνικό δείκτη, π.χ., ER/PgR/HER2 σε καρκινώματα μαστού.

Αξιολογούνται:

• Η έκφραση της πρωτεΐνης σε κακοήθη κύτταρα, π.χ., ER/PgR σε καρκινώματα μαστού.

• Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε κακοήθη κύτταρα, π.χ., HER2 σε καρκινώματα μαστού.

• Η έκτοπη έκφραση υβριδικής πρωτεΐνης (προϊόν χρωμοσωμικής μετάθεσης / ανασυνδυασμού, βλ. παρακάτω), ακόμη κι αν το αντίσωμα που ανιχνεύει την πρωτεΐνη δεν είναι ειδικό για το προϊόν του υβριδικού γονιδίου που αποτελεί τον δείκτη για τα φάρμακα. Χαρακτηριστικά παραδείγματα, η παρουσία ALK, ROS1 σε μη-μικροκυτταρικά καρκινώματα πνεύμονα.

Γονιδιακή ενίσχυση: αύξηση του αριθμού γονιδιακών αντιγράφων που σχετίζονται με θεραπευτική επιλογή.

• Χαρακτηριστικό παράδειγμα η ενίσχυση του γονιδίου ERBB2 (HER2) στον καρκίνο του μαστού για την επιλογή αντι-HER2 θεραπείας.

Μεταλλάξεις: αλλαγή στη νουκλεοτιδική αλληλουχία του DNA που αφορά σε αντικατάσταση μεμονωμένων βάσεων, ή προσθήκες / ελλείψεις μικρού αριθμού βάσεων.

• Στα κυτταρολογικά υλικά αξιολογείται η παρουσία / απουσία της μετάλλαξης (ΝΑΙ / ΟΧΙ, ποιοτικός προσδιορισμός). Αξιολόγηση του φορτίου μετάλλαξης στο δείγμα (VAF) προς το παρόν δεν συνιστάται.

• Ο έλεγχος γίνεται σε DNA, απαιτείται ταυτοποίηση της νουκλεοτιδικής αλλαγής και, στα κυτταρολογικά υλικά, γίνεται αυστηρά με extract-based μεθόδους (Βλ ενότητα Γ παρακάτω).

• Επί του παρόντος, έλεγχος στα κυτταρολογικά υλικά γίνεται για μεταλλάξεις με αποδεδειγμένη κλινική σημασία (οδηγοί ανάπτυξης όγκου, drivers) για την καθοδήγηση θεραπευτικής επιλογής (actionable mutations)

• Ο έλεγχος EGFR μεταλλάξεων (εξόνια 18, 19, 20, 21) στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα περιλαμβάνεται πλέον στις κλινικές οδηγίες και για τα κυτταρολογικά υλικά

• Βεβαίως, εφόσον πληρούνται οι προϋποθέσεις για TC και ποιότητα DNA, ο έλεγχος μπορεί να γίνει σε κυτταρολογικό υλικό για οποιαδήποτε actionable μετάλλαξη για θεραπευτική επιλογή.

Χρωμοσωμικές μεταθέσεις / ανασυνδυασμοί: ανιχνεύουμε την αλλαγή θέσης χρωμοσωμικών τμημάτων με αποτέλεσμα τη δημιουργία υβριδικού γονιδίου, το προϊόν του οποίου λειτουργεί ως οδηγός της αύξησης του όγκου και αποτελεί φαρμακευτικό στόχο.

• Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι και πάλι οι μεταθέσεις ALK, ROS1, NRTK σε καρκινώματα πνεύμονα.

• Εκτός από την καθοδήγηση της θεραπευτικής επιλογής, αυτού του τύπου οι γενωμικές αλλαγές αποτελούν διαγνωστικό εργαλείο για πολλούς τύπους όγκων, κυρίως μαλακών μορίων και λεμφωμάτων (signature translocations).

• Εφόσον δεν υπάρχει ιστολογικό υλικό και εφόσον πληρούνται οι προϋποθέσεις επάρκειας TC, είναι δυνατός ο διαγνωστικός προσδιορισμός χρωμοσωμικών μεταθέσεων σε υλικό FNA, π.χ., signature translocations σε σαρκώματα / λεμφώματα που ενδέχεται να αποτελούν φαρμακευτικούς στόχους (π.χ., ALK μεταθέσεις σε φλεγμονώδεις μυοϊνοβλαστικούς όγκους).

Φορτίο μεταλλάξεων όγκου (tumor mutational burden, TMB): προσδιορίζεται με NGS (next generation sequencing) και αντιστοιχεί στον αριθμό μεταλλάξεων ανά Mb (megabase, 10^6 βάσεις). O δείκτης έχει ενδιαφέρον για την πρόβλεψη απάντησης σε ανοσοθεραπευτικά αντισώματα και βρίσκεται υπό αξιολόγηση σε ιστολογικά υλικά και σε cfDNA, αλλά όχι ακόμη σε κυτταρολογικά υλικά. Προφανώς δεν θα είναι αξιόπιστος ο προσδιορισμός σε αρχειοθετημένα πλακίδια.

Γ. Μοριακές μέθοδοι για προβλεπτικούς δείκτες στην Κυτταρολογία

Οι μέθοδοι που εφαρμόζονται στη διαγνωστική για τη διερεύνηση μοριακών δεικτών σε κυτταρολογικά υλικά ομαδοποιούνται βασικά σε 2 κατηγορίες:

Γ.1. Μέθοδοι in situ: ανοσοκυτταροχημεία και εφαρμογές in situ υβριδισμού (κυρίως FISH).

Οι διαγνωστικές in situ μέθοδοι ανιχνεύουν ένα μοριακό δείκτη ανά αντίδραση (το πολύ δύο)

Ανοσοκυτταροχημεία (ICC)

• Ως μέθοδος, η ICC χρησιμοποιείται ευρέως για την κατάδειξη της έκφρασης πρωτεϊνών μέσα στα κύτταρα, αλλά πρέπει να προτυποποιείται στο κάθε εργαστήριο για τον κάθε δείκτη που ελέγχεται.

• Επιβάλλεται η χρήση αντισωμάτων ή και αντιδραστηρίων με έγκριση για διαγνωστική χρήση (IVD)

• Καταλληλότερο υλικό για την ICC είναι το cell-block, εφόσον υπάρχει διαθέσιμο, ειδικά για δείκτες όπου η αξιολόγηση περιλαμβάνει προσδιορισμό % σε συγκεκριμένο αριθμό κακοήθων κυττάρων

• Εφόσον δεν υπάρχει cell block, η εφαρμογή ICC για φαρμακευτικούς δείκτες θα πρέπει να προβλέπεται και να πραγματοποιείται στο επιστρωμένο παρασκεύασμα στην αρχή της διαγνωστικής διαδικασίας. Πλακίδια LBC μπορεί να επιστρωθούν για την εφαρμογή ICC δεικτών αξιόπιστα κατά τους 3 πρώτους μήνες αποθήκευσης, πρακτικά μέχρι και 6μηνο, κατά ορισμένους μέχρι και 12 μήνες

• Το περιεχόμενο σε κακοήθη κύτταρα και ο αποκλεισμός μη-κακοήθων θετικών κυττάρων καθορίζουν την αξιοπιστία του αποτελέσματος

• Πρωτεϊνικοί δείκτες που αποτελούν προϊόντα μετάθεσης μπορούν να αξιολογηθούν και σε επιστρωμένα πλακίδια ή πλακίδια υγρής φάσης ( απαραίτητα μονιμοποιημένα ή σε αιθανόλη ή σε μεθανόλη) π.χ., ALK στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα.

• Εφόσον υπάρχουν, εφαρμόζονται υποχρεωτικά τα συνοδευτικά διαγνωστικά τεστ (companion diagnostic tests, CDTs) με τις προτεινόμενες τροποποιήσεις σε σχέση με τα ιστολογικά, π.χ., PD-L1 για pembrolizumab στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, σε τομές cell block με TC >50% . Λόγω της επιτακτικής κλινικής ανάγκης, η ανάγκη για την προτυποποίηση του αποτελέσματος και σε υλικό κυτταρολογικής λήψης επείγει.

• Οι ισχύουσες οδηγίες για δείκτες με θετικότητα σε % συγκεκριμένου αριθμού κακοήθων κυττάρων ΠΡΕΠΕΙ να τροποποιηθούν για χρήση σε κυτταρολογικά υλικά.

• Προσδιορισμός μεταλλαγμένων πρωτεϊνών με ειδικά αντισώματα, π.χ., για τις πιο συχνές μεταλλάξεις EGFR (exon 19 del, L858R ) ή BRAF V600E δεν συνιστάται προς το παρόν (παρά το αντίθετο δημοσιευμένο συμπέρασμα ), κυρίως σε κυτταρολογικά υλικά, για την καθοδήγηση θεραπευτικής επιλογής.

Φθορίζων in situ υβριδισμός (FISH) και οι παραλλαγές του

• Η μέθοδος χρησιμοποιείται για την κατάδειξη της ακεραιότητας και του αριθμού αντιγράφων χρωμοσωμικών τμημάτων σε μεσοφασικούς πυρήνες κακοήθων κυττάρων.

• Δείκτες για τους οποίους υπάρχουν συστήματα IVD για τον προσδιορισμό των παραπάνω χρωμοσωμικών αλλαγών μπορούν να προσδιορισθούν σε κυτταρολογικό υλικό, κυρίως σε τομές cell block (παρότι ο πυρήνας παρουσιάζεται σε τομές, ενώ στο επιστρωμένο υλικό είναι ολόκληρος) για τους λόγους που αναφέρθηκαν παραπάνω.

• Συστήματα IVD υπάρχουν για μεγάλο αριθμό δεικτών χρωμοσωμικών μεταθέσεων, καθώς και για ζεύγη ή τριπλέτες γονιδίου/κεντρομεριδίου για τον προσδιορισμό της αντίστοιχης γονιδιακής ενίσχυσης.

• Η μέθοδος είναι αποδεκτή για τον προσδιορισμό μεταθέσεων ALK σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα και χρησιμοποιείται για την τυποποίηση νεοπλασμάτων του αιμοποιητικού και σαρκωμάτων

• Εφόσον απαιτείται, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κατάδειξη γονιδιακής ενίσχυσης, κυρίως για ERBB2 (HER2) σε καρκινώματα μαστού. Ωστόσο, για τον ίδιο δείκτη, οι εφαρμογές CISH / SISH για γονιδιακή ενίσχυση, οι οποίες διεθνώς χρησιμοποιούνται σε ιστολογικές τομές, δεν μπορούν να έχουν αξιόπιστη εφαρμογή σε κυτταρολογικά παρασκευάσματα, πλην εργαστηρίων που έχουν επικυρώσει τη μέθοδο CISH σε κυτταρολογικά παρασκευάσματα υγρής φάσης.

• Οι εφαρμογές της μεθόδου ποικίλλουν

  • κατά σύστημα όγκου υπό διερεύνηση

  • ανάλογα με το κλινικό κέντρο.

• Ωστόσο, η επιλογή των πυρήνων για αξιολόγηση, ακόμη και σε τομές cell-block, απαιτεί ακόμη μεγαλύτερη εμπειρία απ’ ότι σε ιστολογικές τομές. Παρόμοια ισχύουν για την καταμέτρηση του αναγκαίου αριθμού πυρήνων που είναι απαραίτητοι για την αξιολόγηση του δείκτη.

• Επιπλέον, ο FISH έχει μεγαλύτερο κόστος από την ICC και απαιτεί εξειδικευμένη υποδομή.

Γ.2. Μέθοδοι που περιλαμβάνουν εξ ολοκλήρου ή σε κάποιο στάδιο PCR (PCR-based) σε εκχυλίσματα DNA/RNA (extract-based):

• Περιλαμβάνουν αντιδράσεις που χρησιμοποιούν μία ή περισσότερες πολυμεράσες ποικίλου πλέον τύπου και δυνατοτήτων, για να εμπλουτίσουν το μοριακό υπόστρωμα με τους γενωμικούς στόχους που μας ενδιαφέρουν, ώστε να μπορούμε να τους αναλύσουμε. Πρακτικά, όλες οι μέθοδοι που αναλύουν το DNA σε επίπεδο νουκλεοτιδίου περιλαμβάνουν κάποιο στάδιο ενίσχυσης του γενωμικού στόχου με πολυμεράση.

• Ανιχνεύουν αλλαγές στην αλληλουχία του DNA και γενωμικές μεταθέσεις, και τελευταία, αριθμό γονιδιακών αντιγράφων με άμεσο (ανάλυση αλληλουχίας) ή έμμεσο (στοχευμένη ανάλυση μεταλλάξεων) τρόπο.

• Κυριότεροι τύποι είναι:

  • απλή ή πολλαπλή κλασσική PCR και ηλεκτροφόρηση (σπάνια για φαρμακευτικούς δείκτες),

  • real time PCR και οι άπειρες παραλλαγές της:

    • διαφορετικοί τύποι ανιχνευτών (hybridization, Taqman-MGB, Scoprions, etc etc) με διαφορετική ευαισθησία – ειδικότητα για την στοχευμένη ανίχνευση συγκεκριμένων μεταλλάξεων,

    • χωρίς χρήση ανιχνευτών (HRM)

    • με ενίσχυση του στόχου υπό διερεύνηση πριν τον πολυμερισμό η οποία αυξάνει εξαιρετικά την ευαισθησία (digital droplet PCR, BEAMing),

    • με απόκτηση άδειας ως companion diagnostic (π.χ., COBAS EGFR mutation test v2)

    • ανίχνευση προϊόντων έκφρασης υβριδικών γονιδίων (υπόστρωμα RNA, σπάνια χρήση για φαρμακευτική επιλογή)

  • όλες οι μέθοδοι ανάλυσης αλληλουχίας: Sanger sequencing (dd-sequencing, cycle sequencing), pyrosequencing, next generation sequencing (NGS), κυρίως το ευρέως πλέον χρησιμοποιούμενο panel of targeted NGS (ειδικά το σύστημα με ημιαγωγούς) αλλά και το whole genome ή exome sequencing

    • το targeted NGS έχει πλέον ευρεία χρήση και στη διαγνωστική, ειδικά για την ανίχνευση γενωμικών αλλαγών που προβλέπουν απάντηση σε συγκεκριμένα φάρμακα

• Όλες οι PCR-based μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε κυτταρολογικά υλικά με την προϋπόθεση ότι:

  • το κυτταρολογικό υλικό θα περιέχει τον προτεινόμενο για την ευαισθησία της μεθόδου ελάχιστο αριθμό ή % κακοήθων κυττάρων

  • το κυτταρολογικό υλικό θα έχει υποστεί κατάλληλη επεξεργασία για την απομόνωση καλής ποιότητας / επαρκούς ποσότητας μοριακού υποστρώματος. (απαραίτητος έλεγχος ποιότητας μοριακού υποστρώματος)

  • ο μοριακός δείκτης που ψάχνουμε μπορεί επαρκώς να ανιχνευθεί με τη μέθοδο που επιλέγουμε στο υλικό που εξετάζουμε (μοριακό υπόστρωμα με γνωστή προέλευση όσον αφορά την TC)

• Ευνόητο ότι, όσο πιο άμεσα (=πιο κοντά στη λήψη) επεξεργαστούμε το κυτταρολογικό υλικό για την εκχύλιση μοριακού υποστρώματος, τόσο καλύτερης ποιότητας DNA/RNA θα πάρουμε (λογική για την πρόταση προοπτικής επεξεργασίας στην Εικόνα 1).

• Η ευαισθησία των PCR-based μεθόδων στην ανίχνευση των υπό διερεύνηση γενωμικών αλλαγών συναρτάται άμεσα από την ποσότητα, αλλά κυρίως από την ποιότητα του μοριακού υποστρώματος

Συνολική αποτίμηση και συμπεράσματα

Οι ανάγκες για τη διερεύνηση μοριακών δεικτών σε κυτταρολογικά υλικά αυξάνονται και, ως Κυτταρολόγοι, θα πρέπει να προσαρμόσουμε την πρακτική μας σ’ αυτές . Η γνώση του σωστού χειρισμού των κυτταρολογικών υλικών από μέρους μας, ώστε να είναι χρήσιμα για περαιτέρω μοριακή ανάλυση, είναι θεμελιώδους αξίας, ακόμη και αν οι εξετάσεις αυτές δεν διενεργούνται στο δικό μας εργαστήριο. Οι εγγενείς περιορισμοί των κυτταρολογικών υλικών δεν αποκλείουν τη χρήση τους για τον προσδιορισμό μοριακών δεικτών για θεραπευτικές επιλογές. Το επείγον και απαραίτητο για τη σωστή διερεύνηση των μοριακών δεικτών είναι το πώς-πότε-γιατί στην επεξεργασία των κυτταρολογικών υλικών. Πέρα από τις επιπλέον γνώσεις που απαιτούνται για το σύνολο του προσωπικού που απασχολείται στο Κυτταρολογικό Εργαστήριο, και τα όσα αναφέρθηκαν για κάθε υλικό – δείκτη – μέθοδο, χρήσιμα για την αλλαγή της πρακτικής στο Κυτταρολογικό Εργαστήριο προς την εδραίωση της μοριακής διαγνωστικής είναι:

• Η αξιολόγηση κόστους / οφέλους στην επιλογή των μεθόδων διαχείρισης του υλικού

• Η βελτίωση των μεθόδων λήψης του υλικού (διεπιστημονικό αντικείμενο)

• Η πραγματοποίηση του συνόλου της διαδικασίας (λήψη υλικού στην κλινική – επεξεργασία στο κυτταρολογικό εργαστήριο) σε οργανωμένο κλινικό κέντρο

• Η παρασκευή cell block κατά το δυνατόν

• Η διαπίστευση του εργαστηρίου για τη διαχείριση του υλικού και την εφαρμογή in situ μεθόδων

• Η βελτίωση της δυνατότητας προσδιορισμού της TC στα κυτταρολογικά υλικά

• Η διαπίστευση του εργαστηρίου για τον αξιόπιστο προσδιορισμό μοριακών δεικτών με in situ μεθόδους (ICC / FISH κ.τ.λ.) – συμμετοχή σε ελέγχους ποιότητας (EQA)

• Η πρόβλεψη για πιθανή ανάγκη χρήσης PCR-based μεθόδων και η κατάλληλη επεξεργασία προς τον σκοπό αυτό

• Η διαρκής αξιολόγηση των μεθόδων απομόνωσης DNA / RNA που θα χρησιμοποιηθούν για PCR-based μεθόδους

• Η κατανόηση ότι η εφαρμογή PCR-based μεθόδων αποτελεί διακριτή ενότητα της εργαστηριακής πρακτικής και χρήζει ανάλογης υποδομής και εξειδίκευσης. Εκείνο που χρειάζεται να αποδίδει το Κυτταρολογικό Εργαστήριο είναι DNA (και RNA) κατά το δυνατόν υψηλής ποιότητας με γνωστό περιεχόμενο Tumor Cellularity (TC)

• Η επιλογή της μεθόδου διερεύνησης θα πρέπει να γίνεται με βάση τις διεθνείς οδηγίες (εφόσον υπάρχουν) και τις αποζημιώσεις από το Σύστημα Υγείας, και να εξατομικεύεται με βάση τις δυνατότητες του εργαστηρίου, του κυτταρολογικού δείγματος, και του κόστους/οφέλους της εφαρμογής

• Όταν απαιτείται προσδιορισμός πολλαπλών δεικτών με διαφορετικές μεθόδους, θα πρέπει να αξιολογηθεί το κόστος/όφελος των εφαρμογών αυτών για ένα μόνο δείκτη ανά αντίδραση ανά μέθοδο σε σύγκριση με τις διαπιστευμένες πλέον για την απόδοσή τους εφαρμογές NGS που αποδίδουν πληροφορίες για πληθώρα σημαντικών γενωμικών αλλαγών για θεραπευτική επιλογή.

• Η παρακολούθηση του διεθνούς γίγνεσθαι και των διεθνών οδηγιών ως προς τους μοριακούς δείκτες για θεραπευτική επιλογή

• Η συμμετοχή των εργαστηρίων σε εθνικές και διεθνείς επιστημονικές ομάδες.

Σε συνεργασία με τις υπόλοιπες διαγνωστικές ειδικότητες και οπωσδήποτε με τις κλινικές ειδικότητες μπορούμε να βελτιστοποιήσουμε τον έλεγχο των κυτταρολογικών υλικών για μοριακούς δείκτες που καθοδηγούν θεραπευτικές επιλογές προς όφελος των ασθενών, που είναι το ζητούμενο σε κάθε ιατρική πρακτική.

Βιβλιογραφία

1. Personalized, genotype-directed therapy for advanced non-small cell lung cancer 

2. Lindeman NI, Cagle PT, Aisner DL, Arcila ME, Beasley MB, Bernicker EH, Colasacco C, Dacic S, Hirsch FR, Kerr K et al: Updated Molecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors: Guideline From the College of American Pathologists, the International Association for the Study of Lung Cancer, and the Association for Molecular Pathology. Archives of pathology & laboratory medicine 2018, 142(3):321-346.

3. Jain D, Roy-Chowdhuri S: Molecular Pathology of Lung Cancer Cytology Specimens: A Concise Review. Archives of pathology & laboratory medicine 2018, 142(9):1127-1133.

4. Fassan M: Molecular Diagnostics in Pathology: Time for a Next-Generation Pathologist? Archives of pathology & laboratory medicine 2018, 142(3):313-320.

5. da Cunha Santos G, Saieg MA, Troncone G, Zeppa P: Cytological preparations for molecular analysis: A review of technical procedures, advantages and limitations for referring samples for testing. Cytopathology 2018, 29(2):125-132.

6. Kalemkerian GP, Narula N, Kennedy EB, Biermann WA, Donington J, Leighl NB, Lew M, Pantelas J, Ramalingam SS, Reck M et al: Molecular Testing Guideline for the Selection of Patients With Lung Cancer for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors: American Society of Clinical Oncology Endorsement of the College of American Pathologists/International Association for the Study of Lung Cancer/Association for Molecular Pathology Clinical Practice Guideline Update. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2018, 36(9):911-919.

7. Kotoula V, Charalambous E, Biesmans B, Malousi A, Vrettou E, Fountzilas G, Karkavelas G: Targeted KRAS mutation assessment on patient tumor histologic material in real time diagnostics. PloS one 2009, 4(11):e7746.

8. Torous VF, Rangachari D, Gallant BP, Shea M, Costa DB, VanderLaan PA: PD-L1 testing using the clone 22C3 pharmDx kit for selection of patients with non-small cell lung cancer to receive immune checkpoint inhibitor therapy: are cytology cell blocks a viable option? Journal of the American Society of Cytopathology 2018, 7(3):133-141.

9. Straccia P, Brunelli C, Rossi ED, Lanza P, Martini M, Musarra T, Lombardi CP, Pontecorvi A, Fadda G: The immunocytochemical expression of VE-1 (BRAF V600E-related) antibody identifies the aggressive variants of papillary thyroid carcinoma on liquid-based cytology. Cytopathology 2019.

Εκ μέρους του ΔΣ της Ελληνικής Εταιρείας Κλινικής Κυτταρολογίας

Η Συντακτική Ομάδα

• Κωτούλα Βασιλική, Ιατρός Κυτταρολόγος, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής με Εξειδίκευση στη Μοριακή Παθολογία

• Νασιουτζίκη Μαρία, Γενική Γραμματέας Ελληνικής Εταιρείας Κλινικής Κυτταρολογίας

• Πολίτη Αικατερίνη, Ιατρός Κυτταρολόγος, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Κυτταρολογίας Ε.Κ.Π.Α.

• Οι ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα έχουν κακή πρόγνωση, με μέση επιβίωση 1 έτους. Ο προσδιορισμός της ογκογονικής ενεργότητας ορισμένων κινασών τυροσίνης σε προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα, ιδιαίτερα με τις ενεργοποιητικές μεταλλάξεις στο γονίδιο EGFR και αναδιατάξεις στα γονίδια ALK ή ROS1, έχουν μετατοπίσει το ενδιαφέρον στην ανάπτυξη ειδικών στοχευμένων μοριακών θεραπειών με μικρομοριακούς αναστολείς κινάσης τυροσίνης (TKI), παρέχοντας σημαντική βελτίωση της επιβίωσης και της ποιότητας ζωής. Για την εξατομικευμένη επιλογή του κατάλληλου στοχευτικού φαρμάκου για τους ασθενείς με καρκίνο πνεύμονα, θα πρέπει να διαπιστώνεται αν ο όγκος φέρει κάποια από τις μοριακές αλλαγές που σχετίζονται με ευαισθησία/αντοχή στα συγκεκριμένα φάρμακα. Ο έλεγχος για την παρουσία αυτών των μοριακών αλλαγών γίνεται με μοριακές δοκιμές σε υλικό από τον όγκο.

• Είναι σημαντικό, αυτές οι δοκιμές να περιλαμβάνουν, πέραν των προαναφερθέντων μοριακών τροποποιήσεων για τις οποίες εγκρίνονται στοχευμένες θεραπείες από εγκεκριμένους φορείς όπως η Αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA), και μοριακές μεταβολές για τις οποίες υπάρχουν αναμφισβήτητα αποδεικτικά στοιχεία για αποτελεσματικές στοχευμένες θεραπείες (και πιο πρόσφατα, ανοσοθεραπείες) από δημοσιευμένες κλινικές μελέτες.

• Οι τελευταίες κατευθυντήριες οδηγίες των Επιστημονικών Ενώσεων College of American Pathologists (CAP), International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC), και Association for Molecular Pathology (AMP) (Arch Pathol Lab Med Vol142 March 2018), οι οποίες υιοθετούνται και από την Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Κυτταρολογίας, περιλαμβάνουν τις παρακάτω συστάσεις:

Ανάλυση σε κυτταρολογικό υλικό είτε του πρωτοπαθούς όγκου (προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα) είτε της μετάστασης για EGFR και ALK ή ROS1 για όλους τους ασθενείς που φέρουν στοιχεία αδενοκαρκινώματος, ανεξάρτητα από τα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενούς.

• Οι τελευταίες Κατευθυντήριες Οδηγίες εστιάζουν και σε 6 βασικά σημεία – κλειδιά: 1) Ποια νέα γονίδια να υπόκεινται σε έλεγχο ρουτίνας για μεταβολές σε καρκίνο του πνεύμονα; 2) Ποιες μέθοδοι είναι κατάλληλες για έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα με ιδιαίτερη έμφαση στη χρήση Ανοσοϊστοχημείας και Αλληλούχισης Επόμενης Γενιάς (NGS); 3) Υπάρχει ανάγκη ελέγχου σε ασθενείς με καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο, μικροκυτταρικό ή άλλα μη αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα; 4) Ποιος έλεγχος ενδείκνυται σε ασθενείς με στοχεύσιμη μεταβολή που έχει υποτροπιάσει μετά από την αρχική ανταπόκριση στην κατάλληλα στοχευμένη θεραπεία; 5) Ποιος είναι ο ρόλος του ελεύθερου κυκλοφορούντος DNA (circulating cell-free DNA) στη διαχείριση ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα; 6) Ποια η διαγνωστική υποβοήθηση για τον ρόλο των ανοσο-θεραπειών ( πχ. PDL1) που απαιτείται κατά τη διαδικασία επαναξιολόγησης;

• Αξίζει να σημειωθεί ότι ολοένα και συνεχώς νέα επιτεύγματα αναμένονται στο πεδίο της στοχευμένης θεραπείας, cf-DNA διαγνωστικής και ανοσο-θεραπειών.

• Σύμφωνα με τις νέες κατευθυντήριες οδηγίες, οι βιοδείκτες διαχωρίζονται σε 3 κατηγορίες:

1^η : οι βιοδείκτες που πρέπει οπωσδήποτε να χρησιμοποιηθούν (Standard of care) σε ασθενείς με προχωρημένο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα για την επιλογή και χορήγηση εγκεκριμένου στοχευτικού φαρμάκου. Στους βιοδείκτες αυτούς συμπεριλαμβάνονται οι μεταλλάξεις EGFR (ενεργοποιητικές, ευαισθησίας και αντοχής), ALK (μεταθέσεις) και ROS1 (μεταθέσεις).

2^η : οι βιοδείκτες που θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για την ένταξη ασθενών σε κλινικές μελέτες και να συμπεριλαμβάνονται σε κάθε μεγάλο πάνελ αλληλούχισης για τον καρκίνο του πνεύμονα, και που δεν απαιτούνται για εργαστήρια που διενεργούν μονογονιδιακές δοκιμές.

3^η : βιοδείκτες που βρίσκονται υπό αξιολόγηση χωρίς σαφή κλινική σημασία, οι οποίοι δεν είναι κατάλληλοι για κλινική χρήση επί του παρόντος.

Επίσης, οι οδηγίες ακολουθούνται από ένα σύστημα τριπλής διαβάθμισης αναφορικά με τη δυναμική της σύστασης (επιβεβλημένη, γνώμη της επιτροπής ειδικών, μη σύσταση).

Μετα-αναλυτική διαδικασία

• Σύντομο χρονικό διάστημα έκδοσης αποτελέσματος (turn-around time)

=< 2 εβδομάδες

• Κατάλληλη εκτίμηση του αποτελέσματος

• Επικοινωνία με Κλινικό Ιατρό

Βιβλιογραφία

• Ellison G, Zhu G, Moulis A, Dearden S, Speake G, McCormack R. EGFR mutation testing in lung cancer: a review of available methods and their use for analysis of tumour tissue and cytology samples. J Clin Pathol. 2013;66(2):79–89. doi:10.1136/jclinpath-2012-201194

• Lindeman NI, Cagle PT, Aisner DL, Arcila ME, Beasley MB, Bernicker EH, Colasacco C, Dacic S, Hirsch FR, Kerr K, Kwiatkowski DJ, Ladanyi M, Nowak JA, Sholl L, Temple-Smolkin R, Solomon B, Souter LH, Thunnissen E, Tsao MS, Ventura CB, Wynes MW, Yatabe Y. Updated Molecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors: Guideline From the College of American Pathologists, the International Association for the Study of Lung Cancer, and the Association for Molecular Pathology. Arch Pathol Lab Med. 2018;142(3):321-346. doi: 10.5858/arpa.2017-0388-CP.

• da Cunha Santos G, Saieg MA, Troncone G, Zeppa P. Cytological preparations for molecular analysis: A review of technical procedures, advantages and limitations for referring samples for testing. Cytopathology. 2018;29(2):125-132. doi: 10.1111/cyt.12534.

• Sequist LV, Neal J. Personalized, genotype-directed therapy for advanced non-small cell lung cancer (2019) https://www.uptodate.com/contents/personalized-genotype-directed-therapy-for-advanced-non-small-cell-lung-cancer

Εκ μέρους του ΔΣ της Ελληνικής Εταιρείας Κλινικής Κυτταρολογίας

Η συντακτική ομάδα

• Νασιουτζίκη Μαρία, Γενική Γραμματέας Ελληνικής Εταιρείας Κλινικής Κυτταρολογίας

• Κωτούλα Βασιλική, Ιατρός Κυτταρολόγος, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής με Εξειδίκευση στη Μοριακή Παθολογία

• Βαβουλίδης Ελευθέριος MSc PhD(c), Μοριακός Γενετιστής

• Πολίτη Αικατερίνη, Ιατρός Κυτταρολόγος, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Κυτταρολογίας Ε.Κ.Π.Α.

• Ο ρόλος της αναρρόφησης δια λεπτής βελόνας (FNAC) σε ποικίλες ψηλαφητές ή μη αλλοιώσεις του μαστού είναι καλά εδραιωμένος στην κλινική πράξη ως μία ελάχιστα επεμβατική τεχνική χαμηλού κόστους. Σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού, είναι εξαιρετικά χρήσιμη η FNAC ως μέρος της τριπλής αξιολόγησης στην επιβεβαίωση διάγνωσης της κακοήθειας. Επίσης, στην αξιολόγηση του λεμφαδενικού status (staging) και στη διάγνωση της μεταστατικής νόσου.

• Nεο-επικουρικές θεραπείες έχουν σημαντικό ρόλο στη θεραπεία χειρουργήσιμων όγκων του μαστού με στόχο την βελτίωση της χειρουργικής αντιμετώπισης. Οι συχνότεροι βιοδείκτες που χρησιμοποιούνται σήμερα σε στοχευμένες θεραπείες είναι οι οιστρογονικοί υποδοχείς (ER), προγεστερονικοί υποδοχείς (PR) και human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). Επίσης, είναι γνωστό ότι οι παραπάνω βιοδείκτες διαφέρουν μεταξύ της πρωτοπαθούς και μεταστατικής νόσου, γεγονός που καταδεικνύει την αναγκαιότητα νέας δειγματοληψίας σε περιπτώσεις υποτροπής.

• Εφόσον το υλικό από αναρρόφηση δια λεπτής βελόνης είναι το μόνο διαθέσιμο για διαγνωστική προσέγγιση ρουτίνας ή σε προχωρημένες καταστάσεις όπου η χειρουργική αντιμετώπιση δεν είναι δυνατή ή επίσης και σε μεταστατική νόσο, δύναται να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των HER-2/neu, ΕR / PR ως ένα cost-effective μοντέλο για αρχική διαχείριση ασθενών με καρκίνο του μαστού.

• Κυτταρολογία υγρής φάσης (LBC) έχει μεγαλύτερο πλεονέκτημα έναντι της συμβατικής κυτταρολογίας λόγω της χρήσης του εναπομείναντος υλικού για επικουρικές τεχνικές. Κατάλληλη εκπαίδευση για αξιολόγηση επιχρισμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης είναι απαραίτητη προς αποφυγή διαγνωστικών σφαλμάτων. Επίσης, η αξιολόγηση των επικουρικών τεχνικών καλόν είναι να γίνεται από δύο ιατρούς. Σύμφωνα με τις οδηγίες της American Cancer Society η χρήση κυτταρολογίας υγρής φάσης (TP) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ρουτίνα για το βιολογικό χαρακτηρισμό του διηθητικού καρκινώματος του μαστού. Απαραίτητη προϋπόθεση η ύπαρξη τουλάχιστον 100 καρκινικών κυττάρων σε LBC δείγματα.

• Μεγάλης σημασίας η προτυποποίηση της κάθε μεθόδου.

• Χρυσός κανόνας είναι όλα τα slides να περιέχουν επαρκή κυτταρικό πληθυσμό.

• Αντίθετα από τα ιστολογικά παρασκευάσματα, η αξιολόγηση της αξιοπιστίας ER/PR σε κυτταρολογικό υλικό διεθνώς έχει γίνει σε μικρό αριθμό δειγμάτων.

• Τα κριτήρια για την αξιολόγηση της κατάστασης HER2 αφορούν προς το παρόν μόνο ιστολογικά παρασκευάσματα. Για την εκτίμηση των κυτταρολογικών θα πρέπει να έχει αποκλεισθεί η παρουσία μυοεπιθηλιακών κυττάρων.

HER-2 υπερέκφραση ή γονιδιακή ενίσχυση

• Ο καρκίνος του μαστού παρουσιάζει ενίσχυση/υπερέκφραση του γονιδίου HER-2/neu σε ~ 20-30% των περιπτώσεων. Ο ακριβής προσδιορισμός της έκφρασης του γονιδίου HER-2/neu στην κλινική πράξη είναι μεγάλης σημασίας και αξίας σε περιπτώσεις στοχευτικής θεραπείας.

• Γενικότερα, δείγματα προερχόμενα από αναρρόφηση δια λεπτής βελόνης (FNA) δεν είναι τα πλέον κατάλληλα για εκτίμηση HER-2, δεδομένου ότι ο διαχωρισμός μεταξύ διηθητικού και in situ καρκινώματος δεν είναι εφικτός με ακρίβεια σε αυτά τα υλικά. Στις περιπτώσεις που έχει κλινική εφαρμογή, διενεργείται με αξιοπιστία με τις παρακάτω τεχνικές:

1. Ανοσοκυτταροχημική διερεύνηση (ICC)

2. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)

3. Chromogenic in situ hybridization (CISH)

4. Silver in situ hybridization (SISH)

Είδος υλικού:

1. Κυτταρολογία Υγρής Φάσης (LBC) – CISH και SISH καλύτερα αποτελέσματα

2. Συμβατικά απευθείας επιχρίσματα - εξίσου καλά αποτελέσματα σε FISH

3. Cell-block (μεθανόλη ή 10% ουδέτερη φορμόλη) – εξαιρετικά αποτελέσματα κυρίως σε ανοσοκυτταροχημική διερεύνηση

Αλγόριθμος διαχείρισης κυτταρολογικού υλικού για HER-2 δοκιμές

Προαναλυτική διαδικασία (ICC):

• Ανάλογα με το είδος του υλικού

• Τομές από cell-block πρέπει να διεκπεραιώνονται εντός 1 ή 2 ημερών για αποφυγή απώλεια της έκφρασης HER-2/neu. Συνιστάται η χρήση φρεσκοκομμένων τομών.

• Εφόσον χρησιμοποιείται cell block, είναι σημαντικό οι τομές να αριθμούνται και να λαμβάνονται σε σειρά: τομή για μικροσκοπική διάγνωση και 3 τομές για ανοσοϊστοχημεία και στη συνέχεια 1 τομή για FISH/CISH (στα 4μm, ανάλογα με τα πρωτόκολλα του εργαστηρίου)

• Είναι προτιμότερη η χρήση διαπιστευμένων και εγκεκριμένων εμπορικών κιτ (companion diagnostic tests).

• Εφόσον δεν χρησιμοποιούνται companion diagnostics, θα πρέπει να προτυποποιείται και να διαπιστεύεται η μεθοδολογία και να χρησιμοποιούνται διαπιστευμένοι μάρτυρες

Αξιολόγηση αποτελέσματος (ICC) ) σε τομές ιστολογικών παρασκευασμάτων:

• Η μέθοδος χρησιμοποιείται για την ημιποσοτική εκτίμηση της έκφρασης της πρωτεΐνης HER2

• Her-2 status θα πρέπει να καθορίζεται μόνο στο διηθητικό τμήμα του όγκου

• Her-2 θετικό μόνον σε μεμβρανική χρώση

• Scoring: 0 έως 3+

• Δείγματα scoring 3+ αναμφίβολα θετικά για υπερέκφραση HER2

• Δείγματα scoring 0 / 1+ αναμφίβολα αρνητικά

• Δείγματα borderline scoring 2+ διφορούμενα

Υποχρεωτική σύσταση για FISH/CISH

• Απαιτείται κατάλληλη εκπαίδευση και διαπίστευση του εργαστηρίου για τις δοκιμασίες HER2 (ανοσοκυτταροχημεία και FISH/CISH)

• Εάν δεν είναι δυνατή η διάκριση μεταξύ in situ και διηθητικού καρκινώματος στο cell block θα πρέπει να διενεργούνται δείκτες για μυοεπιθηλιακά κύτταρα

• Image analysis δεν συστήνεται επί του παρόντος ως εναλλακτική της αξιολόγησης μέσω του scoring (ανεπαρκή δεδομένα).

Προαναλυτική διαδικασία (ISH):

• Ανάλογα με το είδος του υλικού

• Είναι προτιμότερη η χρήση έγκυρων εμπορικών κιτ.

• Πλήρη προτυποποίηση της μεθοδολογίας (cell-block, επώαση, έκπλυση, υβριδισμός) για διατήρηση πυρηνικής ακεραιότητας και χρήση επικυρωμένων controls

Αξιολόγηση αποτελέσματος (ISH) σε τομές ιστολογικών παρασκευασμάτων:

• Η μέθοδος χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό γονιδιακής ενίσχυσης HER2

• Όλο το πλακίδιο θα πρέπει να σαρώνεται πριν την αξιολόγηση για περιπτώσεις παρουσίας ετερογένειας και να συγκρίνεται με το αντίστοιχο πλακίδιο ανοσοκυτταρο/ιστοχημείας

• Ο αριθμός των χρωμοσωμάτων 17 (ανιχνευτής για κεντρομερίδιο 17, ανιχνευτής CEN17) θα πρέπει να μετράται αρχικά σε 20 ή, εφόσον κρίνεται σκόπιμο, σε 60 μη αλληλοεπικαλυπτόμενους πυρήνες κακοήθων νεοπλασματικών συνεχιζόμενων κυττάρων χρησιμοποιώντας τουλάχιστον 3 διακριτά πεδία καρκινικών κυττάρων. Παράλληλα μετράται ο αριθμός των φωτεινών σημάτων για τη χρωμοσωμική περιοχή HER2 (ανιχνευτής HER2). Για τον κάθε ανιχνευτή υπολογίζεται ο μέσος αριθμός σημάτων ανά κύτταρο

• Εκτίμηση αποτελεσμάτων ISH:

  • Αρνητικό: λόγος (ratio) σημάτων HER2/CEN17 <2 ΚΑΙ μέσο (average) αριθμό φωτεινών σημάτων HER2 <4 ανά κύτταρο

  • Οριακό: ratio HER2/CEN17 1.8-1.99 ή ratio HER2/CEN17 <2 ΚΑΙ average φωτεινών σημάτων HER2 4 - <6 ανά κύτταρο  οι μετρήσεις επαναλαμβάνονται σε 60 καρκινικούς πυρήνες (εφόσον υπάρχουν) και εν ανάγκη, σε διαφορετικό υλικό από τον ίδιο όγκο (εφόσον υπάρχει διαθέσιμο)

  • Θετικό: ratio HER2/CEN17 ≥2 ή average φωτεινών σημάτων HER2 ≥6 ανά κύτταρο

• Απαιτείται κατάλληλη εκπαίδευση και εμπειρία

• Her-2 status θα πρέπει να καθορίζεται μόνο στο διηθητικό τμήμα του όγκου

• Εάν δεν είναι δυνατή η διάκριση μεταξύ in situ και διηθητικού καρκινώματος στο cell block θα πρέπει να διενεργούνται δείκτες για μυοεπιθηλιακά κύτταρα

• Image analysis δεν συστήνεται επί του παρόντος ως εναλλακτική της αξιολόγησης μέσω του scoring (ανεπαρκή δεδομένα).

• Η έκθεση αποτελέσματος θα πρέπει να περιλαμβάνει:

-scoring

-μέσο αριθμό αντιγράφων (copy number) για τα HER-2 & CEP17

-αναλογία (ratio) HER-2/CEP17

-πιθανό πρόβλημα στο χειρισμό ή την επεξεργασία του υλικού μη συμβατό με τις οδηγίες

Αξιολόγηση αποτέλεσματος (scoring) για IHC και FISH σε τομές ιστολογικών παρασκευασμάτων

Μετα-αναλυτική διαδικασία

• Σύντομο χρονικό διάστημα έκδοσης αποτελέσματος (turn-around time)

• Κατάλληλη εκτίμηση του αποτελέσματος

• Επικοινωνία με Κλινικό Ιατρό

ΕΚΦΡΑΣΗ ΟΡΜΟΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ER / PR

Οι ορμονικοί υποδοχείς εκφράζονται συχνά στον καρκίνο του μαστού: οιστρογονικοί υποδοχείς ανιχνεύονται ανοσοϊστοχημικά περίπου στο 80% και οι προγεστερονικοί υποδοχείς στο 60-70% των διηθητικών καρκινωμάτων. Η θετικότητα σε αυτούς τους υποδοχείς συνδέεται με ανταπόκριση σε ορμονική θεραπεία και καλύτερη έκβαση.

Είδος υλικού:

1. Κυτταρολογία Υγρής Φάσης (LBC) – καλύτερα αποτελέσματα συγκριτικά με τα συμβατικά – φύλαξη σε θερμοκρασία δωματίου, κατάψυξη ή βαθιά κατάψυξη έως 6 μήνες παρέχει αξιόπιστα αποτελέσματα χωρίς απώλεια της κυτταρικής αντιγονικότητας

2. Συμβατικά απευθείας επιχρίσματα (air-dried ή ethanol-fixed)

3. Cell-block (μεθανόλη ή 10% ουδέτερη φορμόλη) – εξαιρετικά αποτελέσματα κυρίως σε Ανοσοκυτταροχημική διερεύνηση

4. Cytospins

Προαναλυτική διαδικασία:

• LBC (ThinPrep)

-airdried για 24 ώρες και μετά μονιμοποίηση σε 4% buffered φορμαλδεϋδη για 15’ πριν την ανοσοχρώση σε αυτόματο μηχάνημα ανοσοχρώσης

-πλεονέκτημα η δυνατότητα χρήσης γνωστών θετικών περιπτώσεων ως μάρτυρες ελέγχου (controls)

• Cell-block

- μονιμοποίηση σε φορμόλη 6-8 ώρες

-τομές πάχους 4μm

-αποπαραφίνωση και ενυδάτωση

• Air-dried απευθείας επιχρίσματα

-επώαση με ammonium chloride σε θερμοκρασία δωματίου για 2’ για απομάκρυνση αιμορραγικών στοιχείων, μετά μονιμοποίηση σε μεθανόλη και τέλος σε φορμόλη για 10΄για απόσπαση της ενδογενούς υπεροξειδάσης.

-τρεχούμενο νερό για 5΄και αποσταγμένο για 5΄.

• Για αντιγονική ανάκτηση, όλων των ειδών τα δείγματα επωάζονται σε 10-mM citrate buffer solution (pH 6) για 20’ σε φούρνο μικροκυμάτων (απευθείας επιχρίσματα για PR ή HER2 30΄σε χύτρα ταχύτητος). Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση με αντίσωμα σε ειδικό αυτόματο μηχάνημα ανοσοχρώσης.

• Είναι προτιμότερη η χρήση διαπιστευμένων και εγκεκριμένων εμπορικών κιτ (companion diagnostic tests).

• Εφόσον δεν χρησιμοποιούνται companion diagnostics, θα πρέπει να προτυποποιείται και να διαπιστεύεται η μεθοδολογία και να χρησιμοποιούνται διαπιστευμένοι μάρτυρες

Αξιολόγηση αποτελέσματος :

• ER / PR θετικοί: >10% των κυττάρων με θετική πυρηνική χρώση ανεξάρτητα από την ένταση της χρώσης (LBC).

• ER / PR αρνητικοί: < 10% των κυττάρων με θετική πυρηνική χρώση ανεξάρτητα από την ένταση της χρώσης (LBC).

• ER/PR θετικοί (ιστολογικό παρασκεύασμα): >1% των κυττάρων με θετική πυρηνική χρώση ανεξάρτητα από την ένταση της χρώσης (established cut-off)

• Σύστημα Αξιολόγησης Allred (LBC): βασισμένο σε συνολική βαθμολογία που προκύπτει από επιμέρους παραμέτρους:

% ποσοστό θετικών κυττάρων ( εύρη τιμών: 0, 0-1, 1-10, 10-33, 33-66, >66)

σκορ έντασης χρώσης (τιμές: 0, 1, 2, 3)

ένταση θετικής χρώσης (καμία, ασθενής, ενδιάμεση, έντονη)

Συνολική βαθμολογία 0-2: αρνητικό αποτέλεσμα

Συνολική βαθμολογία 3-8: θετικό αποτέλεσμα

Μετα-αναλυτική διαδικασία

• Σύντομο χρονικό διάστημα έκδοσης αποτελέσματος (turn-around time)

• Κατάλληλη εκτίμηση του αποτελέσματος

• Επικοινωνία με Κλινικό Ιατρό

Βιβλιογραφία

• Wolff AC, Hammond MEH, Allison KH, Harvey BE et al (2018) Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Clinical Practice Guideline Focused Update. Archives of Pathology & Laboratory Medicine 142(11):1364-1382.

• Durgapal, P. , Mathur, S. R., Kalamuddin, M. , Datta Gupta, S. , Parshad, R. , Julka, P. K. and Panda, S. K. (2014), Assessment of Her‐2/neu status using immunocytochemistry and fluorescence in situ hybridization on fine‐needle aspiration cytology smears: Experience from a tertiary care centre in India. Diagn. Cytopathol. 42:726-731. doi:10.1002/dc.23088

• Rakha EA, Pinder SE, Bartlett JMS On behalf of the National Coordinating Committee for Breast Pathology, et al (2015) Updated UK Recommendations for HER2 assessment in breast cancer Journal of Clinical Pathology 68:93-99.

• Toi P.C., Neelaiah S., Dharanipragada K., Surendra K. (2018) Evaluation of estrogen and progesterone receptors and Her-2 expression with grading in the fine-needle aspirates of patients with breast carcinoma, Journal of Cytology 35(4): 223-228.

• Gerhard R, Schmitt FC (2014) Liquid-based cytology in fine-needle aspiration of breast lesions: a review. Acta Cytol. 58(6):533-42. doi: 10.1159/000362805.

• Shabaik A, Lin G, Peterson M, Hasteh F, Tipps A, Datnow B, Weidner N (2011) Reliability of HER2/neu, estrogen receptor, and progesterone receptor testing by immunohistochemistry on cell block of FNA and serous effusions from patients with primary and metastatic breast carcinoma. Diagn Cytopathol 39: 328–33.

• Domanski AM, Monsef N, Domanski HA, Grabau D, Fernö M. (2013) Comparison of the oestrogen and progesterone receptor status in primary breast carcinomas as evaluated by immunohistochemistry and immunocytochemistry: a consecutive series of 267 patients. Cytopathology 24(1):21-5. doi: 10.1111/j.1365-2303.2012.00997.x.

• Peggolo E, Machin P, Riosa F, Bassini A, Deroma L, Di Loreto C (2012) Hormone receptor and human epidermal growth factor receptor 2 status evaluation on ThinPrep speciments from breast carcinoma : correlation with histologic sections determinations. Cancer cytopathology 120(3) : 196-205,doi: 10,1002/cncy.20206

• Tripathy K., Mishra A., Singh AK, Panda PL, Mahapatra A, Lenka A (2018) Immunocytochemistry using Liquid-based Cytology: A Tool in Hormone Receptor Analysis of Breast Cancer. J Cytol 2018;35:260-4.

• Hammond ME, Hayes DF, Dowsett M, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer [published correction appears in Arch Pathol Lab Med. 2010 Aug;134(8):1101]. Arch Pathol Lab Med. 2010;134(6):907–922. doi:10.1043/1543-2165-134.6.907

Εκ μέρους του ΔΣ της Ελληνικής Εταιρείας Κλινικής Κυτταρολογίας

Η συντακτική ομάδα

• Νασιουτζίκη Μαρία, Γενική Γραμματέας Ελληνικής Εταιρείας Κλινικής Κυτταρολογίας

• Κωτούλα Βασιλική, Ιατρός Κυτταρολόγος, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής με Εξειδίκευση στη Μοριακή Παθολογία

• Βαβουλίδης Ελευθέριος MSc PhD(c), Μοριακός Γενετιστής

Εισαγωγή

• Οι οζώδεις βλάβες του Θυρεοειδούς αδένα αποτελούν συχνό κλινικό πρόβλημα. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η συχνότητα εμφάνισης ψηλαφητών θυρεοειδικών όζων είναι περίπου 5% στις γυναίκες και 1% στους άνδρες που ζουν σε περιοχές του κόσμου με επάρκεια ιωδίου(1,2). Αντίθετα, η υπερηχοτομογραφία υψηλής ανάλυσης (US) μπορεί να ανιχνεύσει όζους του θυρεοειδούς σε ποσοστό 19% -68% τυχαία επιλεγμένων ατόμων, με υψηλότερες συχνότητες στις γυναίκες και τους ηλικιωμένους (3,4). Η κλινική σημασία της διαγνωστικής διερεύνησης των όζων θυρεοειδούς έγκειται στην ανάγκη αποκλεισμού του καρκίνου του θυρεοειδούς, ο οποίος εμφανίζεται σε 7% -15% των περιπτώσεων ανάλογα με την ηλικία, το φύλο, το ιστορικό έκθεσης σε ακτινοβολία, το οικογενειακό ιστορικό και άλλους παράγοντες (5).

• Ο διαφοροποιημένος καρκίνος του θυρεοειδούς, ο οποίος περιλαμβάνει το θηλώδες καρκίνωμα και το θυλακιώδες καρκίνωμα, αφορά τη μέγιστη αναλογία (> 90%) όλων των καρκίνων του θυρεοειδούς. Σύμφωνα με δημοσίευση από την American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer 2015 (6), η ετήσια επίπτωση σχεδόν τριπλασιάστηκε στις Ηνωμένες Πολιτείες από 4.9 ανά 100.000 το 1975 σε 14.3 ανά 100.000 το 2009 . Σχεδόν ολόκληρη αυτή η μεταβολή της επίπτωσης αποδίδεται στην αύξηση της συχνότητας εμφάνισης του θηλώδους καρκινώματος (PTC). Επιπλέον, το 25% των νέων καρκίνων του θυρεοειδούς που διαγνώστηκαν το 1988-1989 ήταν ≤1 εκ σε σύγκριση με το 39% των νέων διαγνώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς το 2008-2009 (7). Η μετατόπιση αυτή μπορεί να οφείλεται στην αυξανόμενη χρήση της υπερηχοτομογραφίας του τραχήλου ή σε άλλες απεικονιστικές μεθόδους για πρώιμη διάγνωση και θεραπεία (8), τάσεις που αλλάζουν την αρχική θεραπεία και την παρακολούθηση για πολλούς ασθενείς με καρκίνο του θυρεοειδούς. Μέχρι το 2019, μια μελέτη προβλέπει ότι το θηλώδες καρκίνωμα θα γίνει ο τρίτος συνηθέστερος καρκίνος στις γυναίκες με κόστος 19-21 δισεκατομμυρίων δολαρίων στις Ηνωμένες Πολιτείες (9).

• Επομένως, παρατηρείται εκσεσημασμένη αύξηση του θυρεοειδικού καρκίνου τις τελευταίες δεκαετίες, οφειλόμενη στο θηλώδες καρκίνωμα ( PTC ) λόγω:

Α. αύξησης της ανίχνευσης των θυρεοειδικών όζων με απεικονιστικές μεθόδους Β. αύξησης της συχνότητας των διαγνώσεων του θυλακιώδους τύπου του θηλώδους καρκινώματος.

• Αλλά, παρά αύξηση των PTC το ποσοστό θνητότητας παραμένει σταθερό. Ένας από τους κύριους στόχους αυτών των κατευθυντήριων οδηγιών είναι η ελαχιστοποίηση ενδεχόμενων βλαβών από την υπερθεραπεία σε μια πλειονότητα ασθενών με χαμηλό κίνδυνο θνησιμότητας και νοσηρότητας, ενώ παράλληλα αντιμετωπίζονται και παρακολουθούνται κατάλληλα οι ασθενείς με υψηλότερο κίνδυνο.

Ποια είναι η κατάλληλη εργαστηριακή και απεικονιστική αξιολόγηση σε ασθενείς με όζους του θυρεοειδούς που ανιχνεύονται κλινικά ή τυχαία;

► Μέτρηση θυρεοτροπίνης ορού

► Μέτρηση θυρεοσφαιρίνης ορού

► Μέτρηση καλσιτονίνηςορού

► Τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων φθοριοδεοξυγλυκόζης ([18F]Fluorodeoxyglucose)

► υπερηχοτομογραφία θυρεοειδούς

► υπερηχοτομογραφία για τη λήψη απόφασης διενέργειας παρακέντησης δια λεπτής βελόνης (FNA)

► συστάσεις από τη διαγνωστική παρακέντηση δια λεπτής βελόνης (FNA) ενός όζου σε συσχέτιση και με το υπερηχοτομογραφικό πρότυπο

Ποιος είναι ο ρόλος της παρακέντησης δια λεπτής βελόνης (FNA) ;

Η FNA αποτελεί διαγνωστική διαδικασία επιλογής, στην αξιολόγηση των όζων του θυρεοειδούς αδένα, μετά από κλινική υπόδειξη.

► Ερμηνεία των μορφολογικών και ανοσοκυτταροχημικών ευρημάτων σε κυτταρολογικό υλικό

► Μοριακός έλεγχος σε υλικό ασθενών με όζους του θυρεοειδούς αδένα ( προεγχειρητική διάγνωση-πρόγνωση)

Διαγνωστική ορολογία σε δείγματα FNA θυρεοειδούς

• Οι οζώδεις αλλοιώσεις, δημιουργούν ενίοτε κλινικά διλήμματα ως προς τον τρόπο διαχείρισης των ασθενών. Παρόλο που η εξέταση υλικού με παρακέντηση δια λεπτής βελόνης (FNA) αποτελεί την πλέον αποτελεσματική μέθοδο προεγχειρητικής διάγνωσης, σε ποσοστά περίπου 60% και 15% (συνολικά 70-80%) οι αλλοιώσεις αναφέρονται αντίστοιχα ως καλοήθεις ή κακοήθεις (10), με 92% αρνητική προγνωστική αξία για τις καλοήθεις διαγνώσεις και 100% θετική προγνωστική αξία για την κακοήθεια. Στο υπόλοιπο 20% των όζων, το κυτταρολογικό αποτέλεσμα είναι ασαφές (αμφίβολο) (11). Τα ανεπαρκή (μη διαγνωστικά) αποτελέσματα αποτελούν περίπου το 10% των περιπτώσεων.

• Ο σημαντικότερος ρόλος ενός διαγνωστικού σχήματος που χρησιμοποιεί η Κλινική Κυτταρολογία, είναι ο σαφής καθορισμός της βλάβης, ώστε να παρέχεται η δυνατότητα εφαρμογής της διαγνωστικής πληροφορίας στην κλινική πρακτική με σταθερό και αναπαραγώγιμο τρόπο, για τον κατάλληλο χειρισμό του ασθενούς. Επιπλέον, σημαντική θεωρείται, η αναφορά του σχετικού ανά διαγνωστική κατηγορία κινδύνου κακοήθειας με τις αντίστοιχες συστάσεις κλινικής διαχείρισης. Για να αντιμετωπιστεί μια σημαντική μεταβλητότητα στην αναφορά των κυτταρολογικών διαγνώσεων σε δείγματα FNA θυρεοειδούς, το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI) των ΗΠΑ προτείνει, από το 2008, την εφαρμογή της ορολογίας ενός νέου συστήματος ταξινόμησης που αναφέρεται ως “The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology (TBSRTC) ” και αποτελείται από έξι διαγνωστικές κατηγορίες (12). Η φιλοσοφία του συστήματος TBSRTC είναι ότι, κάθε διαγνωστική κατηγορία υποδεικνύει αναλογικά ένα ποσοστό κινδύνου κακοήθειας, συσχετίζοντας παράλληλα αυτή την πληροφορία με την οδηγία για την κατάλληλη κλινική διαχείριση του ασθενούς (13).

• Μετά από ευρεία συζήτηση που έγινε το 2009 μεταξύ μελών της Ευρωπαϊκής Ομοσπονδίας Κυτταρολογικών Εταιρειών (European Federation of Cytology Societies) (14), η εφαρμογή του εν λόγω διαγνωστικού συστήματος βρίσκεται υπό εξέταση σε αρκετές Ευρωπαϊκές χώρες (15). Στην Ελλάδα, η διαγνωστική ορολογία κατά Bethesda (TBSRTC) χρησιμοποιείται από το 2010.

Το σύστημα κατά Bethesda(TBSRTC) - διαγνωστικές κατηγορίες

* Οι δύο όροι για αυτές τις κατηγορίες είναι συνώνυμοι. Ένα εργαστήριο θα πρέπει να χρησιμοποιεί μόνον έναν από τους αυτούς για σχετικά αποτελέσματα.

Ποικιλίες του θηλώδους καρκινώματος

• Κλασσικού (συνήθους) τύπου ( Conventional)

• Θυλακιώδους τύπου (follicular variant)

• Θηλώδες μικροκαρκίνωμα (PTMC)

• Υψηλοκυτταρικό ( Tall cell )

• Ογκοκυτταρικό (oncocytic)

• Εκ Κυλινδρικών κυττάρων ( Columnar cell )

• Διάχυτης σκλήρυνσης ( Diffuse sclerosing)

• Συμπαγές Solid)

• Διαυγοκυτταρικό (Clear Cell)

• Ηθμοειδές (Cribriform Morular)

• Μακροθυλακιώδες

• θηλώδες καρκίνωμα με προέχοντα hobnail χαρακτηριστικά

• θηλώδες καρκίνωμα με στρώμα δίκην Οζώδους Περιτονιΐτιδας (PTC/ fasciitis-like stroma)

• Μεικτό θηλώδες και μυελοειδές καρκίνωμα (Combined Papillary and Medullary Carcinoma)

• θηλώδες καρκίνωμα με αποδιαφοροποίηση προς αναπλαστικό καρκίνωμα

Διαγνωστικό σύστημα κατά Bethesda (TBSRTC) 2009

Κίνδυνος Κακοηθείας ( Risk Of Malignancy - ROM ) ανά κατηγορία

Η χρήση της ορολογίας TBSRTC εγκρίθηκε κατά την έκδοση των αναθεωρημένων κατευθυντήριων οδηγιών American Thyroid Association (ATA) του 2015

Αναθεωρημένο Διαγνωστικό σύστημα κατά Bethesda ( TBSRTC ) 2018 μετά και την εισαγωγή της ιστολογικής οντότητας Non - Invasive Follicular Tumor with Papillary - Like Nuclear Structures ( NIFTP )

Η επικαιροποίηση του διαγνωστικού συστήματος κατά Bethesda (TBSRTC) πραγματοποιήθηκε το 2018 με θέματα σχετικά με:

• Ονοματολογία

• Διαφορική διάγνωση

• Πιθανές επιπτώσεις του NIFTP στις ενδιάμεσες διαγνωστικές κατηγορίες

• Χρησιμότητα των μοριακών και ανοσοϊστοχημικών δεικτών

• Κλινική διαχείριση

NIFTP : Ακρωνύμιο για το μη διηθητικό θυλακιώδες νεόπλασμα με πυρηνική μορφολογία ομοιάζουσα με εκείνη του θηλώδους καρκινώματος. Αφορά προτεινόμενη ορολογία για τα νεοπλάσματα ταξινομούμενα μέχρι σήμερα ως « μη διηθητικό θηλώδες καρκίνωμα ( PTC ) θυλακιώδους τύπου ( FVPTC ), περιβαλλόμενο από κάψα »

Το NIFTP δεν παρουσιάζει διακριτές μοριακές μεταλλαγές θηλώδους καρκινώματος όπως η μετάλλαξη BRAF V600E

Αναθεωρημένο Διαγνωστικό σύστημα κατά Bethesda (TBSRTC) 2018

Κίνδυνος Κακοηθείας ( Risk Of Malignancy - ROM ) ανά κατηγορία

* Σύμφωνα με ορισμένες μελέτες, παρέχονται συστάσεις μοριακής ανάλυσης του κυτταρολογικού υλικού για να εκτιμηθεί ο τύπος της χειρουργικής επέμβασης ( λοβεκτομή ή ολική θυρεοειδεκτομή)

Εκτιμώμενες μεταβολές στο κίνδυνο κακοήθειας των διαγνωστικών κατηγοριών TBSRTC λόγω της ιστοπαθολογικής οντότητας του «μη διηθητικού θυλακιώδους νεοπλάσματος με πυρηνική μορφολογία ομοιάζουσα με εκείνη του θηλώδους καρκινώματος (ΝΙ FTP )» Συστάσεις - σχόλια

*Οι αλλαγές στον κίνδυνο κακοήθειας στο σύστημα ταξινόμησης TBSRTC λόγω του NIFTP βασίζονται σε περιορισμένο αριθμό αναδρομικών μελετών

Οι τελευταίες κατευθυντήριες οδηγίες της Επιστημονικής ‘Ένωσης των ΗΠΑ ‟ American Thyroid Association ( ATA )″ υιοθετούνται από την Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Κυτταρολογίας σχετικά με τη διαχείριση ασθενών με οζώδεις αλλοιώσεις του θυρεοειδούς αδένα.

Είδος Κυτταρολογικού Υλικού

Στη σύγχρονη Κλινική Κυτταρολογία, πέραν της συμβατικής άμεσης επίστρωσης υλικού σε επιχρίσματα επί αντικειμενοφόρων πλακών, τόσο η μέθοδος Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ( Liquid Based Cytology) όσο και εκείνη της έγκλεισης υλικού σε παραφίνη (Cell block) επιτρέπουν τη φύλαξη κυτταρολογικού υλικού για επικουρικές μεθόδους χρήσιμες στη διαγνωστική διερεύνηση των ασθενών και την παροχή περαιτέρω διαγνωστικής πληροφορίας στην κλινική ιατρική όπως η εφαρμογή μοριακών (γενωμικών) μεθόδων

• Συμβατικά άμεσα επιχρίσματα (air-dried ή ethanol-fixed) – Φρέσκο ή αρχειακό υλικό

• Κυτταρολογία Υγρής Φάσης (LBC) – καλύτερα αποτελέσματα συγκριτικά με τα συμβατικά επιχρίσματα . Φύλαξη σε θερμοκρασία δωματίου, κατάψυξη ή βαθιά κατάψυξη έως 6 μήνες παρέχει αξιόπιστα αποτελέσματα χωρίς απώλεια της κυτταρικής αντιγονικότητας

• Cell-block (μεθανόλη ή 10% ουδέτερη φορμόλη) – εξαιρετικά αποτελέσματα κυρίως σε Ανοσοκυτταροχημική διερεύνηση

Cell blocks μπορούν να προέρχονται από δείγματα μονιμοποιημένα σε φορμόλη ή αιθανόλη ή αλκοολούχο μονιμοποιητικό διάλυμα υγρής φάσης ή αυτοματοποιημένη τεχνική φυγοκέντρισης και συλλογής του ιζήματος (Cellient), με την τεχνική σε φορμόλη να υπερτερεί σε σχέση με τις άλλες 2 μεθόδους (υλικό σε φυσιολογικό ορό θρομβωμένο με πλάσμα και θρομβίνη ή υλικό σε φορμόλη θρομβωμένο με Histo Gel). -H εκτίμηση της κυτταρικότητας σε cellblocks βασίζεται σε τομές βαμμένες με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η&Ε) πριν και όχι μετά την επεξεργασία για μοριακή ανάλυση.

Εφαρμογή Μοριακών (Γενωμικών) μεθόδων σε κυτταρολογικό υλικό:

Ανίχνευση μονήρους στόχου

• Ενίσχυση :

Ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Ι n situ υβριδισμός ( ISH)

• Ανάλυση Μεταλλάξεων ( mutational analysis ):

Απομόνωση DNA

Απευθείας Αλληλούχιση Sanger

Pyrosequencing

Αλληλούχιση ειδική αλληλομόρφου

Ανοσοϊστοχημεία (IHC)

• Αναδιατάξεις :

Απομόνωση RNA

qRT-PCR

Ι n situ υβριδισμός (ISH)

Ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Ανίχνευση πολλαπλών στόχων

• NGS

• Whole genome sequencing

• Targeted genome sequencing

Ποιες είναι οι αρχές της μοριακής διερεύνησης FNA δειγμάτων;

• Οι μοριακοί δείκτες μπορούν να ταξινομηθούν ανάλογα με την ενδεδειγμένη χρήση τους που μπορεί να είναι για διαγνωστικούς ( ταξινόμηση της κατάστασης της νόσου ), προγνωστικούς , ή προβλεπτικούς σκοπούς παρέχοντας πληροφορία για την εκτιμώμενη πιθανότητα θεραπευτικού αποτελέσματος ή βλάβης από τη συγκεκριμένη θεραπεία (επωφελής ή με συνέπειες). Η επικύρωση μοριακών δοκιμών περιλαμβάνει εξέταση:

(α) αναλυτικής εγκυρότητας (περιλαμβάνοντας τεστ ακρίβειας και αναπαραγωγιμότητας για τον προσδιορισμό του μοριακού φαινομένου)

(β) κλινικής εγκυρότητας (απόδοση του τεστ στη διάκριση διαφορετικών ομάδων ασθενών, βασισμένη στη βιολογία ή εκτιμώμενο αποτέλεσμα της νόσου, περιλαμβάνοντας μέτρηση της ευαισθησίας και ειδικότητας ή των προγνωστικών αξιών), και

(γ) κλινικής χρησιμότητας (εξέταση της ικανότητας του τεστ να βελτιώνει τα αποτελέσματα, με άμεσες συνέπειες βασισμένες στη κλινική απόφαση)

• Η NCCN Tumor Marker Task - Force έχει υποδείξει ότι η κλινική χρησιμότητα ενός μοριακού τεστ θα πρέπει να βασιστεί σε ισχυρές αποδείξεις που θα αποδεικνύουν ότι η χρήση αυτού του δείκτη “ βελτιώνει επαρκώς την έκβαση των ασθενών ώστε να ενσωματωθεί στην κλινική πρακτική ”.

• Όλες οι μοριακές δοκιμές θα πρέπει να διεκπεραιώνονται σε Εργαστήρια Μοριακής Κυτταρολογίας ή Εργαστήρια Αναφοράς που εφαρμόζουν πρακτικές διασφάλισης της εργαστηριακής ποιότητας με CE - IVD αντιδραστήρια έπειτα από σχετική αναλυτική και κλινική επικύρωση των πειραματικών μεθόδων

Ο ρόλος της FNA θυρεοειδούς στην κυτταρολογική ερμηνεία και ο μοριακός έλεγχος σε ασθενείς με οζίδια του θυρεοειδούς;

• Μη διαγνωστική κυτταρολογία Για έναν όζο με αρχικό μη διαγνωστικό κυτταρολογικό αποτέλεσμα, η FNA θα πρέπει να επαναλαμβάνεται με US καθοδήγηση και, εφόσον είναι εφικτό, με on - site κυτταρολογική εκτίμηση

• Καλοήθης κυτταρολογία Εφόσον ο όζος είναι κυτταρομορφολογικά καλοήθης, περαιτέρω άμεσες διαγνωστικές δοκιμές ή θεραπεία δεν απαιτούνται

• Κακοήθης κυτταρολογία Εφόσον ένα κυτταρολογικό αποτέλεσμα είναι διαγνωστικό για πρωτοπαθή κακοήθεια θυρεοειδούς, προτείνεται χειρουργική αντιμετώπιση.

Όμως, η στενή παρακολούθηση μπορεί να θεωρηθεί ως διαδικασία εναλλακτική της άμεσης επέμβασης σε:

( A ) ασθενείς με χαμηλού κινδύνου όγκους (π.χ., θηλώδη μικροκαρκινώματα χωρίς κλινικά εμφανείς μεταστάσεις ή τοπική διήθηση, και ενδεικτική κυτταρολογική εικόνα επιθετικής νόσου),

( B ) ασθενείς υψηλού χειρουργικού κινδύνου

(Γ) ασθενείς που αναμένεται να έχουν μικρό προσδόκιμο ζωής (π.χ., σοβαρή καρδιοπνευμονική νόσος, άλλες κακοήθειες, πολύ προχωρημένη ηλικία), ή

(Δ) ασθενείς με ταυτόχρονα παθολογικό ή χειρουργικής φύσης υπόβαθρο, που θα πρέπει να συνεκτιμηθεί πριν την χειρουργική αντιμετώπιση θυρεοειδούς.

• Μετά από χειρουργική αντιμετώπιση θηλώδους μικροκαρκινώματος θυρεοειδούς( PTMC ), διαμέτρου <1  cm , ποσοστά θνησιμότητας έχουν αναφερθεί <1% ,και ποσοστά υποτροπής 2%–6%, Είναι πολύ πιθανόν ότι αυτά τα εξαιρετικά αποτελέσματα να σχετίζονται περισσότερο με τη φύση της νόσου παρά με την αποτελεσματικότητα της θεραπείας.

• Ομοίως, γνωστά ογκογονίδια του καρκίνου θυρεοειδούς, όπως BRAF , όταν υπολογίζονται ως μεμονωμένα, δεν έχουν την ικανότητα της ειδικής ανίχνευσης μικροκαρκινωμάτων που θα εξελιχθούν και θα επεκταθούν εκτός θυρεοειδούς. Η συχνότητα των μεταλλάξεων   BRAF ^{V 600 E}   σε PTMC με λεμφαδενικές μεταστάσεις και η συχνότητα υποτροπής του όγκου είναι υψηλότερη από ότι σε PTMC χωρίς μεταστάσεις σε λεμφαδένα ή υποτροπή. Μελέτες έδειξαν ότι παρόλο που η παρουσία μίας BRAF ^{V 600 E}   μετάλλαξης ανιχνεύει 65%–77% των ασθενών με PTMC που θα αναπτύξουν λεμφαδενικές μεταστάσεις, η ανίχνευση   BRAF   εκτιμώμενη μεμονωμένα έχει χαμηλή θετική προγνωστική αξία ( PPV ) για την ανεύρεση PTMC με εξωθυρεοειδική επέκταση και επομένως έχει περιορισμένο ρόλο στην διαχείριση του ασθενούς . Όμως, πρόσφατα δεδομένα προτείνουν ότι συγκεκριμένα μοριακά προφίλ, όπως η συνύπαρξη   BRAF   με λοιπές ογκογόνες μεταλλάξεις όπως PIK 3 CA ,   AKT 1 ,   TERT υποδοχέας , ή TP 53   μεταλλάξεις μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως ειδικοί δείκτες για PTC με βιολογική συμπεριφορά λιγότερο ευνοϊκής έκβασης .

• Μελλοντικές μελέτες αναμένονται να καθορίσουν την επίδραση των μοριακών προφίλ που περιλαμβάνουν πολλαπλές μεταλλάξεις ή άλλες γενετικές μεταβολές στη κλινική διαχείριση ασθενών με PTMC .

• Απροσδιόριστη κυτταρολογία (AUS/FLUS, FN, SUSP)

• Η προτεινόμενη χρήση μοριακών δεικτών για δείγματα FNA θυρεοειδούς αμφίβολης κατηγορίας κατά TBSRTC είναι διαγνωστική διαδικασία, για τη λήψη αποφάσεων χειρουργικής αντιμετώπισης. Πρέπει να τονιστεί ότι μακροπρόθεσμα αποτελέσματα από την επικουρική χρήση μοριακών δεικτών για λήψη θεραπευτικής απόφασης επί του παρόντος δεν υπάρχουν, και επομένως δεν γνωρίζουμε εάν η ενσωμάτωση των μοριακών δεικτών στην καθημερινή ιατρική πρακτική θα ωφελήσει τους ασθενείς με όζους θυρεοειδούς.

• Οι μεγαλύτερες μελέτες μοριακών δεικτών προεγχειρητικά σε ασθενείς με απροσδιόριστη FNA κυτταρολογία έχουν αξιολογήσει ένα πάνελ 7 γονιδίων για γενετικές μεταλλάξεις και αναδιατάξεις ( BRAF , NRAS , HRAS , KRAS , RET / PTC 1, RET / PTC 3, και PAX 8/ PPAR γ ) ( 16 ), έναν ταξινομητή γενετικής έκφρασης (167 GEC ; mRNA έκφραση 167 γονιδίων) (17), και galectin -3 άνοσοϊστοχημεία ( cellblocks ) (18). Αυτές οι μελέτες παρουσιάζουν ωστόσο ετερογένεια (16-18) ως προς την έκβαση του αποτελέσματος.

• Η ανάλυση μεταλλάξεων έχει προταθεί για χρήση ως τεστ διαλογής λόγω της υψηλής αναφερόμενης ειδικότητας (86%–100%) και PPV ( 84%–100%) ( 19 ). Παρόλο που η   μεμονωμένη BRAF ^{V 600 E}   ανίχνευση μετάλλαξης έχει εκτιμηθεί ότι έχει ειδικότητα περίπου 99% ( δεδομένα από 1117 όζους με ιστοπαθολογική επιβεβαίωση σε πολλές μελέτες ), η ευαισθησία θεωρείται πολύ χαμηλή ώστε να αποκλειστεί με αξιοπιστία η κακοήθεια . (20,21,22) .

• Έτσι, τα πάνελ μεταλλάξεων έχουν διευρυνθεί ώστε να περιλαμβάνουν πολλαπλές μεταλλάξεις/αναδιατάξεις όπως   BRAF ,   NRAS ,   HRAS , KRAS ,   RET / PTC 1,   RET / PTC 3 , και PAX 8/ PPAR γ   και άλλες γενετικές αναδιατάξεις .

-Σε όζους θυρεοειδούς απροσδιόριστης κυτταρολογίας, η ευαισθησία ενός πάνελ μεταλλάξεων 7 γονιδίων ποικίλλει από 44% έως 100% . Για το λόγο αυτό, πάνελ περιορισμένου αριθμού γονιδίων ενδέχεται να μην αποκλείουν με αξιοπιστία κακοήθεια σε περίπτωση αρνητικού τεστ. Ενώ η ειδικότητα είναι από 84% σε RAS μεταλλάξεις έως 100% σε BRAF, RET/PTC ή PAX8/PPARγ μεταλλάξεις (23).

-Το διαθέσιμο πάνελ των 7 γονιδίων προτάθηκε ως το πλέον χρήσιμο σε περιπτώσεις χειρουργικής αντιμετώπισης, καθόσον η χειρουργική προσέγγιση μεταβάλλεται σε περίπτωση ενός θετικού τεστ, ωστόσο απαιτούνται μακροπρόθεσμα δεδομένα συνολικού οφέλους της θεραπευτικής στρατηγικής. Το εν λόγω πάνελ χρησιμοποιείται με αλγόριθμους λήψης κλινικής απόφασης ως προς την έκταση της χειρουργικής αντιμετώπισης (π.χ., λοβεκτομή ή ολική θυρεοειδεκτομή) (16) που ανανεώνονται συνεχώς, δεδομένου ότι δεν υπάρχει επαρκής βιβλιογραφία ώστε να είναι επίσημες κατευθυντήριες οδηγίες.

• Χρήση του πάνελ 167 GEC ( Afirma gene expression classifier / GEC ) έχει προταθεί ως τεστ αποκλεισμού της κακοήθειας λόγω της υψηλής ευαισθησίας (90%) και NPV (95%) ( 17 ), ενώ, λόγω της σχετικά χαμηλής ειδικότητας του 167 GEC test (53% σε απροσδιόριστους όζους ιστολογικά επιβεβαιωμένους) καθώς και χαμηλής PPV (38%) δεν εγγυάται την παρουσία κακοήθειας στους απροσδιόριστους όζους .

• Κυτταρολογία: θυλακιώδες νεόπλασμα (FN) ή Ύποπτο για Θυλακιώδες νεόπλασμα (SFN)

• Next - generation sequencing ενός διευρυμένου πάνελ σημειακών μεταλλάξεων, προσθαφαιρέσεων μίας βάσης ( indels ), και γενετικών αναδιατάξεων 7 γονιδίων BRAF ,   NRAS ,   HRAS , KRAS ,   RET / PTC 1,   RET / PTC 3 , και PAX 8/ PPAR γ έχει ευαισθησία 90% για κυτταρολογικά δείγματα διαγνωστικής κατηγορίας Θυλακιώδες νεόπλασμα ή Ύποπτο για Θυλακιώδες νεόπλασμα ( FN / SFN ) σε μία μελέτη με ιστολογική επιβεβαίωση ( 24 ) και σε άλλες μελέτες 57-75% (16,19). Επίσης, εμφανίζει ειδικότητα 97-100%, ΡΡ V 87-100% και NPV 79-86% (16,19).

• Όζοι από τους οποίους απουσιάζουν οι παραπάνω μεταλλάξεις έχουν ακόμα σημαντικό κίνδυνο για καρκίνο, καθόσον φέρουν μεταλλάξεις εκτός του πάνελ 7 γονιδίων ( 16 ).

• Χρήση του πάνελ 167 GEC παρουσιάζει 94% NPV και 37%-53% PPV (17) ωστόσο αφορά μελέτες με μικρό δείγμα.

• Κυτταρολογία ύποπτη για κακοήθεια

• Σύσταση για χειρουργική αντιμετώπιση όπως και σε περίπτωση κακοήθειας λαμβάνοντας υπόψιν κλινικούς παράγοντες κινδύνου, υπερηχοτομογραφικά χαρακτηριστικά, προτίμηση ασθενούς και αποτελέσματα πιθανής μοριακής ανάλυσης (εφόσον γίνεται).

• Ένδειξη για μοριακή ανάλυση είτε μόνον για BRAF είτε για το πάνελ των 7 γονιδίων ( BRAF ,   NRAS ,   HRAS , KRAS ,   RET / PTC 1,   RET / PTC 3 , και PAX 8/ PPAR γ) μόνον όταν τα αποτελέσματα αναμένονται να αλλάξουν την απόφαση για χειρουργική αντιμετώπιση, ειδικά μετά από ένα θετικό μοριακό αποτέλεσμα.  

• Οι BRAF   μεταλλάξεις παρέχουν σχεδόν 100% πιθανότητα κακοήθειας σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος ( PPV 100%), με ευαισθησία 36% ( 16 ), γεγονός που μειώνει την αξιοπιστία του σε περίπτωση αρνητικού αποτελέσματος .

• To πάνελ των 7 γονιδίων εμφανίζει ευαισθησία 50%–68%, ειδικότητα 86%–96%, PPV 80%–95%, και Ν PV 72%–75% (16,19).

• Χρήση του πάνελ 167 GEC παρουσιάζει PPV παρόμοια της Κυτταρολογίας (76%) και NPV 85% ( 17 ) και δεν ενδείκνυται σε αυτήν την κυτταρολογική κατηγορία των ασθενών.

Εκτίμηση επίπτωσης BRAF ^{V 600 E}   και άλλων μεταλλάξεων στην επικινδυνότητα θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς

• Σημαντική συσχέτιση BRAF ^{V 600 E}  wild - type μετάλλαξης με θνησιμότητα σε ασθενείς με λεμφαδενικές μεταστάσεις ή απομακρυσμένες μεταστάσεις ή σταδίου Ι V και ηλικία >=45 ετών κατά τη στιγμή της διάγνωσης (25).

• Σημαντική συσχέτιση BRAF ^{V 600 E}  wild - type μετάλλαξης με κίνδυνο υποτροπής ( 26 ) με ποσοστά 2-36% και γενικότερα 11-40% Σημαντικός δείκτης υποτροπής της νόσου

• Σημαντική συσχέτιση BRAF ^{V 600 E}   επίσης με τον ιστολογικό υπότυπο (ποικιλία)

• Σημαντική συσχέτιση BRAF ^{V 600 E}   με θηλώδη μικροκαρκινώματα (<1εκ) (εντοπίζεται στο 30-67% του συνόλου με κίνδυνο υποτροπής 1-7%) ακόμη μικρότερος κίνδυνος όταν είναι T 1 a , N 0, M 0

• Σημαντική συσχέτιση BRAF ^{V 600 E}   με κλινικο-παθολογικούς παράγοντες κινδύνου

• BRAF ^{V 600 E}   δεν συνιστάται η χρήση μεμονωμένα για πρόγνωση καρκίνου

• BRAF ^{V 600 E}   δ εν συνιστάται ως εξέταση ρουτίνας για αρχική εκτίμηση κινδύνου μετά τη χειρουργική θεραπεία σε διαφοροποιημένο καρκίνωμα θυρεοειδούς (δεν είναι ξεκάθαρες οι κλινικές συνέπειες).

• Συσχέτιση ΤΡ53 και ΤΕ RT μεταλλάξεων με θνησιμότητα σε καρκινώματα θυρεοειδούς χαμηλής διαφοροποίησης και αναπλαστικά.

• Συσχέτιση ΤΡ53,   BRAF   και PIK 3 CA μεταλλάξεων με πνευμονικές μεταστάσεις

• Συσχέτιση μεταλλάξεων υποδοχέα TERT με αποδιαφοροποιημένο καρκίνο θυρεοειδούς

• Ο συνδυασμός TERT & BRAF μεταλλάξεων στον ίδιο όγκο ένδειξη υψηλού κίνδυνου υποτροπής ( 27 ).

• Οι μοριακοί δείκτες, εκτός BRAF ,μόνοι ή σε συνδυασμό μπορεί να είναι υποβοηθητικοί στην εκτίμηση του κινδύνου για καρκίνο του θυρεοειδούς παρέχοντας μεγαλύτερη ακρίβεια από ότι μόνον το BRAF test .

Αντιμετώπιση απομακρυσμένων μεταστάσεων

Σε περίπτωση μεταστατικού όγκου, το πάνελ των 7 γονιδίων ( BRAF , NRAS , HRAS , KRAS , RET / PTC 1, RET / PTC 3, και PAX 8/ PPAR γ) δεν έχει χρησιμότητα στη εκτίμηση της πρόγνωσης ούτε στην ανταπόκριση της θεραπείας, αν και, η παρουσία αρκετών μεταλλάξεων   BRAF ^{V 600 E}   ή   PAX 8/ PPAR γ   απαιτούνται για κλινικές δοκιμές.

Η ανάλυση μεταλλάξεων επί του παρόντος δεν συστήνεται ως εξέταση ρουτίνας.

Κατευθύνσεις για μελλοντική έρευνα

Βελτιστοποίηση μοριακών δεικτών για διάγνωση, πρόγνωση και θεραπευτικούς στόχους

• Σημαντική πρόοδος υπήρξε τα τελευταία χρόνια στην κατανόηση των γενετικών μηχανισμών καρκίνου του θυρεοειδούς και στη δημιουργία μοριακών δοκιμών για διάγνωση καρκίνου και πρόγνωση σε όζους του θυροειδούς.

• Η Cancer Genome Atlas ( TCGA ) έχει οδηγήσει στην ανίχνευση μεταλλάξεων και γενετικών τροποποιήσεων σε >90% των καρκίνων θυρεοειδούς, καθιστώντας τον έναν από τους καλύτερα χαρακτηρισμένους γενετικά καρκίνους ( 28 ) εστιάζοντας μόνον στο θηλώδες καρκίνωμα.

• Ν GS επιτρέπει την ανίχνευση αυτών των τροποποιήσεων από ένα μικρό κυτταρικό δείγμα FNA

• Πρόοδος στην ανίχνευση μεταλλάξεων, ή άλλων γενετικών τροποποιήσεων (έκφραση γονιδίων, miRNA ), και επιγενετικών δεικτών αποτελούν μελλοντικούς στόχους στη βελτίωση του εντοπισμού καρκίνου σε όζους του θυρεοειδούς ώστε να παρέχεται πρόγνωση του κινδύνου του καρκίνου με υψηλή ακρίβεια ώστε να μειωθούν δραματικά οι περιπτώσεις αβεβαιότητας σε απροσδιόριστη FNA κυτταρολογία.

• Επιπλέον, όσο το κόστος του NGS μειώνεται και τα αναλυτικά εργαλεία γίνονται πιο αποτελεσματικά, το κόστος των μοριακών δοκιμών αναμένεται να μειωθεί καθιστώντας τα cost - efficient .

• Μεταλλάξεις TP 53, TERT χωρίς ή σε συνδυασμό με BRAF σε καλά διαφοροποιημένα θηλώδη ή θυλακιώδη καρκινώματα σχετίζονται με πιο επιθετική συμπεριφορά του όγκου. Περαιτέρω μελέτες θα προσφέρουν πιο ειδικές πληροφορίες.

• Ερευνητικοί στόχοι αφορούν αποφάσεις θεραπευτικής επιλογής (πχ. έκταση χειρουργικής αντιμετώπισης, θεραπεία με multi - kinase και ειδικούς αναστολείς kinase ή συνδυασμό αυτών).

• Νέες γενετικές μεταλλάξεις/αναδιατάξεις που εμπλέκονται στην παθογένεση του καρκίνου του θυρεοειδούς όπως ALK   και NTRK 3 , αναμένονται να προσφέρουν νέους αποτελεσματικούς θεραπευτικούς στόχους.

• Τέλος, νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις σε γονίδια στόχους που συχνά μεταλλάσσονται στον καρκίνο του θυρεοειδούς όπως γονίδια RAS είναι υπό μελέτη και αναμένεται να ενταχθούν σε μελλοντικές κλινικές δοκιμές.

• Προοδευτικές μακροπρόθεσμες μελέτες όπως RCTs , θα χρειαστούν για να καθορίσουν την κατάλληλη χειρουργική και μετεγχειρητική διαχείριση των ασθενών βασισμένη σε μοριακές δοκιμές, επιτρέποντας περισσότερο εξατομικευμένη αντιμετώπιση αυτών των ασθενών.